基于hiPSC-CM 的新型明膠水凝膠構建體外心肌微組織研究

劉明璐 姜思涵 譚瑤 陳穎 羅潤嬌 盧婷婷 王會景 付煒 游正偉 王偉

組織工程是一種將種子細胞、生物因子和支架材料相結合，形成類似于人體組織的技術，近年來被廣泛應用于器官再生、體外建模、藥物篩選等領域[1-3]。目前常用的支架材料包括明膠、海藻酸鈉、殼聚糖、膠原蛋白、纖維蛋白等[4-7]。明膠因其良好的生物相容性、可降解性，并且具有與體內微環境相似的特質，是最常用的構建體外微組織的支架材料[8]。然而，明膠機械性能差和易溶解性限制了其在生物醫學領域的廣泛應用，需要通過交聯來穩定明膠的聚合物結構并增強明膠的機械性能[9-11]。明膠水凝膠交聯的方法包括離子交聯、熱凝膠、化學交聯、光聚合等[12-14]。

人誘導多能干細胞（Human induced pluripotent stem cells，hiPSC）來源廣泛、不涉及倫理問題、沒有免疫排斥，并且具有向心肌細胞、肝細胞、神經細胞等多種細胞分化的潛能。目前，人誘導多能干細胞來源心肌細胞（Human induced pluripotent stem cellsderived cardiomyocytes，hiPSC-CMs）已經處于比較成熟的階段，是理想的組織工程種子細胞來源[15-17]。

本研究利用明膠制備了一種新型的多功能水凝膠，并對其表面結構、機械性能、細胞相容性進行研究，探索其混合hiPSC-CMs 構建心肌微組織及其凍存的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

hiPSC 來自上海兒童醫學中心李彥欣教授課題組，為臍帶血細胞來源hiPSC。臍帶血捐獻者簽署了相關知情同意書。本研究經上海兒童醫學中心倫理委員會審查批準。

泰斯曼高壓電源（大連泰思曼科技有限公司）、細胞培養箱（Thermo 公司，美國）、掃描電子顯微鏡［泰思肯貿易（上海）有限公司］、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）、臺式單軸拉伸試驗機（Instron 公司，美國）、流式細胞分析儀器（Beckman 公司，美國）、激光共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）。

明膠（Sigma-Aldrich 公司，美國，A 型，來自豬皮）、甘油（Sigma-Aldrich 公司，美國，≥99.0%）、(NH4)2SO4（上海泰坦科技股份有限公司，≥99.5%）、戊二醛（上海麥克林生化科技有限公司，50%）、Ca(NO3)2·4H2O（國藥控股股份有限公司，≥99.0%）、EDTA（Thermo 公司，美國）、基質膠（Cornin 公司，美國）、CHIR99021（Stemcell 公司，加拿大）、PBS 緩沖液（Hyclone 公司，美國）、TeSR-E8 培養基（Stemcell公司，加拿大）、減胰島素B27 添加劑（Thermo 公司，美國）、加胰島素B27 添加劑（Stemcell 公司，加拿大）、Accutase 消化酶（Stemcell 公司，加拿大）、Y-27632（Stemcell 公司，加拿大）、PMI1640（Thermo 公司，美國）、IWP-2（Stemcell 公司，加拿大）、α-Actin抗體（Sigma-Aldrich 公司，美國）、心肌細胞消化液（北京賽貝生物技術公司，中國）、肌鈣蛋白cTnT 抗體（Proteintech 公司，美國）。

1.2 材料制備

將明膠粉末與Ca(NO3)2·4H2O 溶解在去離子水中，50 ℃下持續攪拌至澄清且無氣泡。隨后抽取一定量的明膠水溶液并擠入表面皿中，放入4 ℃冰箱30 min 使其成為凝膠狀。材料由東華大學游正偉教授課題組制備。

1.3 材料冷凍掃描電鏡

將制備好的材料放入2.5%戊二醛溶液中固定過夜，在液氮中速凍30 s，-90 ℃升華10 min，之后以10 mA 的電流濺射鍍金60 s，送入掃描電鏡樣品室觀察，冷臺溫度-140 ℃，加速電壓5 kV，觀察材料的表面形態。

1.4 材料機械性能

機械性能通過萬能試驗機（MTS E42）進行研究，進行循環拉伸測試時，加載和卸載速率均為20 mm/min，拉伸應變范圍為100%，循環次數為10 次。

1.5 hiPSC 的培養、向心肌細胞分化及鑒定

hiPSC 采用TeSR-E8 培養基培養，細胞匯合度達到70%～80%時，EDTA 消化5 min，200× g 離心4 min 后，用含有5 μmol/L Y-27632 的TeSR-E8 培養基按照1∶8～1∶10 重懸，接種到6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中維持培養。每天用PBS 緩沖液清洗后，更換TeSR-E8 培養基。hiPSC 匯合度再次達到80%～85%時，用Accutase 消化酶消化5～7 min，200×g離心4 min 后，接種到12 孔板中，每孔1×106個hiPSC，在37 ℃、5% CO2的濕度培養箱中繼續培養2 d 后，在含有12 μmol/L CHIR99021 的TeSR-E8培養基中進行分化。36 h 后更換為減胰島素B27 培養基，1 d 后更換為含5 μmol/L IWP-2 的減胰島素B27 培養基，分化第5 天更換為減胰島素B27 培養基。自第7 天開始，培養基更換加胰島素B27 添加劑，2 d 更換一次培養基。第10 天可以在12 孔板中觀察到跳動的心肌細胞。

將第15 天的心肌細胞在PBS 中清洗后，用心肌細胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細胞消化液Ⅱ消化20 min，200× g 離心4 min 后，按1×105個/孔的細胞密度接種于預先鋪好基質膠的激光共聚焦小皿上。待完全貼附，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入心肌細胞標志物cTnT 抗體（1∶200）和α-Actin 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 次，每次5 min，添加熒光二抗（1∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細胞相容性

將明膠水凝膠剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，紫外線照射2 h，PBS 清洗3 遍后，將第6 天的心臟前體細胞種在材料上繼續進行心肌細胞分化，在第15 天對細胞進行心肌標志物染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察染色后細胞。將第15 天的心肌細胞固定后，冷凍掃描電鏡觀察細胞在材料表面的形態。

1.7 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構建心肌微組織

將明膠水凝膠90 ℃水浴12 h，使其完全熔化。取第15 天的心肌細胞，PBS 清洗后用心肌細胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細胞消化液Ⅱ消化20 min，200× g 離心4 min 后，去上清，與交聯明膠水凝膠混合構建心肌微組織。用Calcein-AM/ propidium iodide（1∶1 000）避光孵育30 min，在顯微鏡下觀察細胞的存活情況。

1.8 hiPSC-CMs 混合交聯明膠水凝膠構建心肌微組織后凍存

hiPSC-CMs 混合交聯明膠水凝膠構建心肌微組織后，直接放入-80 ℃冰箱凍存，24 h 后取出在37 ℃水浴鍋中復蘇，用Calcein-AM/ propidium iodide（1∶1 000）避光孵育30 min，在顯微鏡下觀察細胞的存活情況。

1.9 溝槽交聯明膠水凝膠

通過Adobe Illustrator 2021 設計了寬度60 μm、深度200 μm 的溝槽模具。再將交聯明膠水凝膠溶液澆筑在溝槽上，冷卻后脫膠，得到了溝槽有序排列的水凝膠。將第10 天的心肌細胞消化后，按10×105個/孔的細胞密度接種于預先鋪好基質膠的材料上，在第15 天左右，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入心肌細胞標志物cTnT 抗體（1∶200）和α-actin 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 次，每次5 min，添加熒光二抗（1∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.10 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統計分析，數據以表示，采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 明膠水凝膠的制備及鑒定

制備好的明膠水凝膠為黃色透明材料。在冷凍掃描電鏡下呈現出均勻疏松多孔結構，孔徑大小1～10 μm（圖1A-D）。制備的交聯水凝膠材料分別在第1 天、第3 天、第7 天進行循環拉伸力學測試，結果顯示明膠水凝膠擁有良好的力學性能（圖1E-G）。

圖1 材料的制備及鑒定Fig.1 Preparation and identification of materials

2.2 hiPSC 的培養、向心肌細胞分化及鑒定

hiPSC 呈克隆樣生長，排列緊密，邊緣清晰，細胞呈較小的圓形，核質比高，細胞核顯著。在hiPSC向心肌細胞分化的過程中，通過添加小分子進行誘導分化，可以觀察到hiPSC 在分化過程發生形態變化，hiPSC 從分化開始時的緊密圓形克隆，逐漸變為近似短棒狀的心肌細胞，在第10 天可以看到自發搏動的心肌細胞（圖2A-E）。第15 天免疫熒光結果顯示，細胞高表達心肌細胞標志物cTnT、α-actin（圖2F-I）。

圖2 hiPSC 細胞培養、分化及鑒定Fig.2 Culture，differentiation and identification of hiPSCs

2.3 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細胞相容性

將第6 天的心臟前體細胞消化后種植在明膠水凝膠膜片上，可以觀察到心肌細胞生長良好，在第10 天心肌細胞開始自發跳動（圖3A）。第15 天的免疫熒光染色結果顯示，心肌標志物cTnT、α-actin 在細胞高表達，表明心臟前體細胞在明膠水凝膠膜片上成功分化為心肌細胞（圖3B）。掃描電鏡結果顯示，心肌細胞在材料上呈現典型短棒狀細胞形態，細胞形態清晰，細胞與細胞之間出現細胞間連接（圖3C）。

圖3 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細胞相容性Fig.3 Cell compatibility of cross-linked gelatin hydrogel with hiPSC-CMs

2.4 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構建體外心肌微組織

將交聯明膠水凝膠置于90 ℃水浴中使其完全熔化，將第15 天的心肌細胞消化后與交聯明膠水凝膠混合，構建體外心肌微組織（圖4A）。構建體外心肌微組織4 h 后，細胞死活實驗顯示，活細胞占62.33%，顯著高于死細胞（36.67%），差異有統計學意義（P＜0.05，圖4B-E）。該結果表明，明膠水凝膠可以對心肌細胞起到保護作用。

圖4 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構建體外心肌微組織Fig.4 hiPSC-CMs mixed gelatin hydrogel for construction of myocardial microtissue in vtro

2.5 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構建心肌微組織后凍存

hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構建的心肌微組織，直接在-80 ℃凍存1 d 后進行復蘇（圖5A-C），細胞死活實驗結果顯示，活細胞比例為16.34%，死細胞比例為83.63%（圖5D-E），直接凍存的心肌微組織中部分細胞存活，明膠水凝膠可能通過提供類似細胞外基質的環境對細胞進行了保護[18]。

圖5 體外構建心肌微組織后的凍存及復蘇Fig.5 Cryopreservation and resuscitation of myocardial microtissue constructed in vitro

2.6 溝槽明膠水凝膠結合hiPSC-CM 的初步研究

根據心肌細胞的大小和有序排列的細胞特性，設計和制備了一種有序排列的、寬度60 μm、深度200 μm 的溝槽模具，在模具中倒入明膠水凝膠溶液制備成溝槽明膠水凝膠膜片（圖6A）。有研究表明，通過表面微環境引導心肌細胞的有序排列有助于促進hiPSC-CM 的成熟[19]。根據掃描電鏡結果，溝槽明膠水凝膠膜片的表面呈現孔徑1～10 μm 疏松多孔的超微結構和排列整齊的溝槽（圖6B）。將第6 天的心臟前體細胞種植在溝槽明膠水凝膠膜片上，發現細胞落在溝槽內，在第10 天左右出現心肌細胞的自發搏動并呈現出一定的有序排列性（圖6C）。免疫熒光結果顯示，溝槽內心肌細胞表達心肌細胞標志物cTnT、α-actin，且細胞沿溝槽有序生長（圖6D）。

圖6 溝槽明膠水凝膠結合hiPSC-CMs 的實驗結果Fig.6 Experimental results of slotted gelatin hydrogel combined with hiPSC-CMs

3 討論

組織工程是一種將種子細胞、生物因子和支架材料結合形成類似于人體組織的技術，廣泛應用于器官再生、體外建模、藥物篩選等領域。常用的明膠水凝膠存在機械性能差和易溶解的問題，許多研究都在通過各種方式致力于提高明膠作為生物墨水的各項性能，以實現其從生物材料向生物應用的轉化[20-21]。此外，hiPSC-CMs 的分化體系目前已處于比較成熟的階段，不涉及倫理學問題，且來源廣泛，是理想的組織工程種子細胞。本研究通過明膠交聯制備了一種多功能明膠水凝膠，可以混合hiPSC-CMs構建體外心肌微組織，并且在長時間的體外微組織構建過程中對細胞有較好的保護作用，構建的組織可以直接凍存，且凍存后有部分細胞存活。此外，制備的溝槽明膠水凝膠對心肌細胞有一定的有序排列引導作用。

綜上所述，明膠水凝膠是一種多功能的組織工程支架材料，對體外構建心肌微組織中的細胞、凍存后細胞具有保護作用。此外，溝槽明膠水凝膠對hiPSC-CMs 的排列有一定影響。后續將對明膠水凝膠圍繞體外構建過程中面臨的抗菌、細胞保護、微組織凍存等問題進行深入研究，并進一步對溝槽明膠水凝膠對hiPSC-CMs 分化、成熟的影響進行探索。