肝細胞生長因子交聯于膠原導管構建神經導管用于面神經損傷修復

田婭媛，張文川，王寒明，王歡，馬富凱

面神經炎癥反應，創傷，腫瘤或手術操作均可能引起周圍性面神經麻痹，周圍性面神經麻痹常常引起患者功能缺失，造成患者審美、心理方面的問題[1-4]。通常情況下，將神經斷端直接縫合重建神經連接是治療面神經損傷的最佳方法，當神經斷端較長時，無法將神經斷端直接縫合。目前，自體神經移植被認為是連接神經斷端的金標準方法，因為它含有雪旺氏細胞和基板，能有效促進神經再生。然而，自體神經移植來源有限，因此需要尋找新的替代自體神經移植的治療策略[5-6]。

前期的研究顯示，使用膠原管連接神經斷端，修復神經損傷時生物兼容性較好。膠原管惰性強，植入體內后不易引起慢性炎癥反應形成疤痕[7-8]，因此本研究使用膠原管橋接神經斷端。研究顯示,肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)在體外實驗中對運動神經元、感覺神經元有營養支持作用[9]。本研究前期使用Traut’s和Sulfo-SMCC，通過兩步化學交聯成功將膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)交聯到膠原材料上[10]。該化學交聯方式不影響GDNF的生物學活性且GDNF的釋放速度得到了有效地控制。為防止HGF從損傷局部大量擴散，本研究探索采用前期工作中的化學交聯法，將HGF通過化學交聯中構建神經導管連接神經斷端，觀察該方法對損傷的面神經的修復作用, 旨在為面神經損傷的治療提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及膠原管 HGF購自(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)。膠原管購自(Renerve,NIPRO,Osaka,Japan)。Traut’s和Sulfo-SMCC購自(Thermo scientific)。雄性SD大鼠購自斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 面神經損傷模型制備及動物分組 本實驗嚴格遵循科技部2006年9月發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定進行。將1 cm長的膠原管與Traut’s試劑反應0.5 h，Sulfo-SMCC試劑與HGF反應0.5 h。隨后將膠原管置于Sulfo-SMCC試劑與HGF反應液中0.5 h，通過化學交聯將HGF錨定在膠原導管內。雄性SD大鼠12只, 體質量180～200 g, 隨機將動物分為HGF組(實驗組)和磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組(對照組)，每組6只。大鼠經4%戊巴比妥納(30 mg/kg) 腹腔麻醉后，在其左側面部切開皮膚，暴露面神經頰支，仔細分離神經及周圍組織，使用手術剪剪去8 mm長面神經頰支，由于神經收縮，造成1 cm長神經缺損，用膠原管連接神經斷端，逐層縫合肌肉、皮膚。在HGF組，2 μg HGF錨定在膠原導管內構建神經導管，對照組膠原管中填充PBS。

1.3 行為學觀察 正常情況下大鼠觸須向前豎起，并有節律拂動。面神經損傷后，觸須即向尾側垂下，且失去拂動能力。術后8周，使用運動評分分析大鼠的功能恢復情況。評分規則如下[11]，0分：觸須無運動；1分：觸須有微量可觀測到的運動；2分：觸須有少量運動；3分：觸須不對稱運動；4分：觸須對稱運動。

1.4 電生理監測 術后8周，將各組大鼠經腹腔麻醉后，使用電生理儀檢測再生神經傳導速度。將刺激電極置于面神經近端，接收電極置于面神經遠端，檢測再生神經的傳導速度。刺激強度為5 V，波寬為0.2 ms，頻率1 Hz。實驗操作在室溫下進行。

1.5 免疫組化 術后8周，將大鼠通過心臟灌注處死。仔細分離、暴露再生的面神經，將新生神經使用4%多聚甲醛固定2 d。隨后將新生神經包埋于石蠟中行切片。經脫水、抗原修復后，使用3%牛血清白蛋白在室溫下將切片封閉40 min。加入抗神經絲蛋白200一抗，將切片放于濕盒內再放入4 ℃冰箱孵育過夜。使用PBS將切片洗滌3次，加入山羊抗鼠IgG二抗，再次使用PBS將切片洗滌3次，加入適量新鮮配置的DAB溶液，放入濕盒內37 ℃孵育；最后使用Harris蘇木素中染色5 min左右，在倒置熒光顯微鏡下采集圖像；陽性染色為棕黃色，細胞核染色為藍色。

1.6 透射電鏡觀察 術后8周，經心臟灌注將大鼠處死，切取左側面神經，將新生神經迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。使用0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。1%的鋨酸·0.1 M PBS(pH 7.4)室溫(20 ℃)固定2 h。0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。組織依次置入50%～70%～80%～90%～95%～100%～100%酒精上行脫水，每次15 min。丙酮∶812包埋劑=1∶1混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜。60 ℃聚合48 h。切片機切片60～80 nm超薄切片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2 結 果

2.1 運動功能分析 各組大鼠面神經損傷后，大鼠觸須即向尾側垂下, 失去拂動能力, 口角歪向健側。術后各組大鼠觸須開始拂動，口角歪斜減輕，隨著時間延長，拂動的幅度加大。HGF組大鼠恢復速度大于PBS組大鼠。至術后第8周時，HGF組大鼠功能評分顯著高于PBS組大鼠，且差別有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 電生理結果 術后第8周，對兩組大鼠進行電生理測試，HGF組大鼠的神經傳導速度顯著高于PBS組大鼠[(47.17±7.13)，(22.5±4.03)，P<0.01] 。見表1。

表1 神經導管修復面神經損傷的效果分析(均值±標準差)

2.3 透射電鏡觀察 術后第8周，透射電鏡結果顯示，HGF組有髓鞘神經纖維直徑顯著大于PBS組，纖維分布較均勻，排列較為規則，纖維間有毛細血管和結締組織，部分纖維呈束狀生長。HGF組髓鞘厚度亦顯著大于PBS組，且差別有統計學意義(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1 電鏡下大鼠各組面神經損傷后再生面神經髓鞘形態

2.4 免疫組化 術后第8周，使用一抗對神經纖維進行染色，觀察HGF組和PBS組面神經的再生情況。結果顯示單位面積下，神經纖維陽性面積在HGF組顯著高于PBS組。統計學結果顯示差別有統計學意義(P<0.01)。見圖2、表1。

陽性染色為棕黃色(免疫組化染色，×40)

3 討 論

周圍神經再生是再生醫學中的研究熱點[12-14]。迄今，面神經損傷后神經功能修復仍然沒有取得滿意的效果。神經橫斷缺損較長，無法通過直接縫合重建神經連接時需要導管連接，引導神經從近端向遠端生長[15-16]。在面神經再生的眾多研究中，很少有解決神經散亂生長和臨床聯帶運動這樣的問題[17]。前期的研究顯示，一些生長因子能夠促進神經損傷后的再生[18-19]。HGF是一種有效的營養因子，最初在干細胞的原代培養中被用作絲裂原而被發現和應用[20]。隨后的研究發現，HGF還參與其他生理活動，如器官再生、血管發生、腫瘤浸潤神經系統的發育等[21]。有研究顯示，周圍神經損傷后HGF受體升高，然而內源性HGF不足以促進神經損傷，外源性HGF在神經損傷修復的早期階段起著重要作用[22]。

本研究將HGF通過化學交聯錨定于膠原導管內構建神經導管用于連接神經斷端，術后8周發現神經導管能橋接神經斷端，引導神經叢近端向遠端生長，到達靶器官，促進運動功能恢復。以膠原導管為載體，將HGF錨定于膠原導管中能防止HGF隨體液流動而大量擴散，使得HGF在損傷局部維持有效的濃度，該神經導管能有效促進神經修復；本研究同時進行了功能和形態學的分析。術后8周，形態學方面，透射電鏡和免疫組化結果顯示，有髓神經纖維的數量和髓鞘厚度在HGF組顯著高于PBS組。功能學方面，觸須運動評分和電生理結果顯示，運動評分和神經傳導速度在HGF組顯著高于PBS組，功能學結果與形態學結果相似。本研究使用膠原導管作為HGF的載體，通過化學交聯防止HGF溶液在體液中大量擴散。研究結果提示，將HGF通過化學交聯錨定于膠原導管構建神經導管能有效促進神經損傷修復。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。