筋骨草總黃酮對單側輸尿管梗阻模型大鼠腎間質纖維化的抑制作用

樓曉慧，南麗紅，彭衛華，陳亞萍，官夢倩

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建 福州 350025；3.福建省免疫性慢性腎病臨床醫學研究中心，福建 福州 350025；4.東部戰區腎臟病醫學中心，福建 福州 350025）

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）被認為是各種慢性腎臟病發生、發展直至終末期腎衰竭的主要病理基礎之一［1］，因此加強對RIF 的發病機制和防治研究尤為必要。目前研究認為RIF 病理過程是在炎癥、缺血、缺氧等因素作用下，成纖維細胞活化增殖，轉分化為肌成纖維細胞并分泌Ⅰ型膠原，最終導致細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）在間質內過度沉積，使腎功能減退直至腎衰竭［2］。有研究發現：在RIF 發生過程中，腎間質中新增成纖維細胞大多來源于腎小管上皮細胞-間充質轉 分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］，因此，EMT 在RIF 發生過程中起關鍵作用。

筋骨草為福建常用中草藥，又名苦草、金瘡小草、白毛夏枯草等，為唇形科植物金瘡小草（Ajuga decumbensThunb.）的全草，其有效成分為黃酮類化合物［4］。前期研究發現筋骨草總黃酮（total flavo?noids of Ajuga，TFA）可降低轉化生長因子-β1（TGFβ1）的表達，減少膠原沉積，具有改善小鼠肺間質纖維化的作用［5］，并有抑制腎小球腎炎系膜增生、改善腎功能的作用［6］。但TFA 是否具有抑制RIF 的作用，目前未見相關報道。故本研究擬采用單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型，探討TFA 對RIF 是否具有干預作用及其可能的作用機制，為其進一步開發應用提供實驗依據。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠40 只，體質量為（180±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002，于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級飼養室飼養1 周，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物與試劑 TFA 粉末（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HG211206）；肌酐（Scr）測定試劑盒（貨號：C011-2-1）、尿素氮（BUN）試劑盒（貨號：C013-2-1）均購自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE 配膠試劑盒（貨號：P0012A）、RIPA 裂解液（貨號：P0013）均購自上海碧云天生物技術有限公司；特超敏化學發光液（大連美侖生物技術有限公司，貨號：ma0186）；β-肌動蛋白（β-actin）一抗（貨號：CPA9100）、上皮鈣黏素（E-cadherin）一抗（貨號：CPA1199）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）一抗（貨號：CPA9212）均購自英國Cohesion Biosciences 公司；HRP 標記山羊抗鼠二抗（貨號：7076P2）、HRP 標記山羊抗兔二抗（貨號：7074s）均購自美國Cell Signal Technology 公司；PVDF 膜（美國Millipore 公司，貨號：ISEQ00010）。

1.3 主要儀器 Infinite 200PRO 多功能酶標儀（瑞士TECAN 公司）；DMi8 倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDoc XRS＋化學發光成像系統（美國Bio Rad 公司）；HM 325 石蠟切片機（美國Thermo Fisher 公司）；Centrifuge 5418 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

2 方 法

2.1 UUO 大鼠模型的制備 將40 只雄性SD 大鼠，按隨機數字表法分為假手術組8 只和造模組32 只。造模組大鼠采用左側輸尿管結扎制備UUO 模型［7］，具體步驟：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg體質量）麻醉；將大鼠固定于操作臺上，備皮，碘伏消毒，鋪洞巾，在左側肋腰點位置逐層切開皮膚、肌肉，暴露左側腎臟，分離出輸尿管；用4-0 絲線在左側輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3 處結扎，在兩道絲線結扎點間剪斷輸尿管以防逆行感染；檢查手術視野無持續出血后，將腎臟置于原位，逐層縫合皮下組織及皮膚，即制備成功UUO 模型［8］。假手術組大鼠僅開腹并分離左側輸尿管，但不結扎和剪斷輸尿管。2 組大鼠術后均予青霉素10 萬U 腹腔注射（1 mL/100 g 體質量），連續3 d 抗感染。

2.2 分組及給藥 造模組造模成功后采用隨機數字表法分為模型組，低、中、高劑量組，每組各8 只。術后第1 天開始給藥，各組均按1 mL/100 g 體質量灌胃，假手術組和模型組灌服蒸餾水，低、中、高劑量組分別灌服54、108、216 mg/mL TFA 水溶液。各組均1 次/d，連續14 d。

2.3 樣本采集 末次給藥2 h 后，麻醉大鼠，打開腹腔，行腹主動脈采血約3 mL，室溫條件下靜置1 h，3 000 r/min 離心15 min，分離血清。然后打開胸腔，暴露心臟，將心包打開，滴少許生理鹽水保持濕潤，在左心室尖剪開一小孔，將連接裝有50 mL 4℃預冷的生理鹽水注射器的灌胃針從小孔插入左心室直至升主動脈內，用止血鉗固定針頭，使灌胃針不能退出心臟，然后進行推注；待見到右心房逐漸膨脹起來時，用小剪刀將右心耳剪開一小孔，使血液排出，如此沖洗直至雙腎變為蒼白色；去除左側腎臟表面被膜及脂肪組織，快速剝離左側腎臟組織，將左側腎臟組織自腎門處作冠狀切面對半剖開，取腎臟組織的1/4 置于4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、石蠟包埋后備用，后期用于HE 染色和Masson染色；剩余腎臟組織放入液氮后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

2.4 觀察指標

2.4.1 Scr、BUN 含量檢測 嚴格按照肌酐測定試劑盒說明書及尿素氮試劑盒說明書，分別采用肌氨酸氧化酶法、脲酶法測定大鼠血清Scr、BUN 含量。

2.4.2 左側腎臟組織病理形態學和纖維化程度觀察 采用“2.3”項中的組織包埋塊，切片，常規脫蠟復水后，分別進行HE 染色和Masson 染色。HE 染色：蘇木素浸染，1%鹽酸酒精分藍，自來水浸泡反藍，伊紅浸染，浸洗，樹脂封片，在倒置熒光顯微鏡400 倍鏡下觀察左側腎臟組織病理改變并攝片。Masson 染色：蘇木素核染5 min，分化液涮洗30 s，1%醋酸分化后水洗反藍，麗春紅品紅染液反應8 min，蒸餾水沖洗后用1%磷鉬酸溶液處理5 min，1%醋酸涮洗，而后0.1%固綠復染15 min，水洗、封片，于倒置熒光顯微鏡400 倍鏡下觀察左側腎臟組織膠原纖維分布情況并攝片。每張切片隨機選取5 個部位進行圖像采集，通過Image J 24.0 軟件分析計算每張切片腎臟組織綠色染色陽性面積（呈綠色染色為膠原纖維陽性表達［9］）占整個視野百分比，得出膠原容積分數（CVF），以此判定大鼠腎臟組織纖維化面積。

2.4.3 Western blot檢測左側腎臟組織中E-cadherin、α-SMA 蛋白相對表達量 每組隨機選取3 只大鼠，取左側腎臟組織約100 mg，加入RIPA 裂解液提取組織中總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制成蛋白樣品，沸水浴15 min 使蛋白變性，制備SDS-PAGE 凝膠，進行電泳、轉膜、封閉；于4℃條件下孵育一抗（β-actin稀釋比為1∶5 000，E-cadherin稀釋比為1∶1 500，α-SMA 稀釋比為1∶10 000）過夜，TBST 洗膜后室溫孵育二抗（HRP 標記山羊抗鼠二抗、HRP 標記山羊抗兔二抗稀釋比均為1∶3 000）70 min，以特超敏ECL 顯影液進行顯影，于ChemiDoc XRS＋化學發光成像系統上成像并拍照。采用Im?age J v1.80 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白條帶與內參蛋白條帶的灰度值比值表示上述蛋白相對表達量。

2.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS 25.0 軟件進行分析。計量資料屬正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Games-Howell 檢測。

3 結 果

3.1 各組血清Scr、BUN 含量比較 見表1。

表1 各組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

表1 各組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

注：與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n8 8 8 8 8 Scr/（μmol/L）32.68±6.67 48.41±5.981）45.10±9.47 27.68±2.262）30.16±8.442）BUN/（nmol/L）6.18±0.44 12.62±2.171）11.31±1.79 9.10±2.233）10.79±3.38

3.2 各組大鼠左側腎臟組織病理形態變化比較 見圖1。HE 染色結果顯示：假手術組大鼠腎小管結構排列整齊，腎小球形態規則，間質正常，未見炎性細胞浸潤；模型組可見腎小管腫大，管腔間隙狹窄，腎小球萎縮，上皮細胞變性、腫大，纖維組織增生明顯，可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，各藥物組腎小管腔擴張，腎小球萎縮、上皮細胞變性、纖維組織增生、炎性細胞浸潤等情況均有所減輕。以上結果顯示TFA 能明顯改善左側腎臟組織病理損傷。

圖1 各組大鼠左側腎臟組織病理形態變化（HE 染色，×400）

3.3 各組大鼠左側腎臟組織纖維化程度比較 見圖2 和表2。Masson 染色結果顯示：假手術組只在腎小管毛細血管周圍、系膜區及腎小球基底膜可見少量膠原；模型組大鼠腎臟間質病變嚴重，腎小管結構明顯破損，有大量膠原形成，間質增寬，纖維化成灶狀分布，腎間質纖維化程度明顯加重；各藥物組均可觀察到腎間質管腔不同程度增寬、膠原纖維不同程度增生的情況，但較模型組均有所減輕。

圖2 各組大鼠左側腎臟組織膠原纖維分布情況（Masson 染色，×400）

表2 各組大鼠左側腎臟組織CVF 比較（±s）

表2 各組大鼠左側腎臟組織CVF 比較（±s）

注：與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n8 8 8 8 8 CVF/%8.13±4.63 55.76±5.31）43.26±3.532）38.69±3.733）42.52±5.443）

3.4 各組大鼠左側腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對表達量比較 見表3 和圖3。

表3 各組大鼠左側腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠左側腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.05。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n3 3 3 3 3 E-cadherin 1.00±0.00 0.18±0.041）0.20±0.04 0.38±0.913）0.24±0.07 α-SMA 1.00±0.00 2.42±0.702）1.86±0.57 1.27±0.113）1.33±0.17

圖3 各組大鼠左側腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白條帶圖

4 討 論

RIF 是各種慢性腎病發展至終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎，EMT 被認為是目前RIF進展中導致ECM 過度沉積的主要病理機制。在EMT 過程中，α-SMA 陽性腎小管上皮細胞移行到腎間質中，活化并增殖成為肌成纖維細胞，其合成并分泌大量膠原，使ECM 過量分泌并積聚排列紊亂，進而導致RIF。EMT 后的細胞由鵝卵石型變成梭形，類似成纖維細胞形態，不再表達上皮細胞標志物E-cadherin，腎小管上皮細胞表達α-SMA 提示其出現轉分化現象［10-11］。因此，α-SMA、E-cadherin是EMT 發生及RIF 的標志性蛋白。

目前研究RIF 的模型較多，但UUO 模型通過結扎單側輸尿管引起腎血流動力學和代謝的明顯改變，可在短期內造成RIF 的病理特點，十分接近于人類RIF 自發的病理過程。大鼠在單側輸尿管梗阻術后，RIF 成模率可達100%［12］，使得UUO 模型成為目前應用最廣泛的RIF 動物模型［13］。PICARD等研究發現：UUO 術后第1 天，腎間質中便可見α-SMA 陽性表達，表明腎間質中成纖維細胞轉分化在UUO 術后早期即可啟動，隨著病變時間持續，腎間質中α-SMA 的表達呈進行性增加［14］。課題組前期通過半定量分析大鼠梗阻側腎臟組織CVF 和α-SMA 蛋白相對表達量以評價UUO 模型制備的成模情況，結果與文獻報道一致［12，14］。故本實驗采用結扎左側輸尿管的方法建立UUO 大鼠模型，并于術后第1 天開始給藥。

本實驗結果表明：UUO 術后大鼠血清Scr、BUN含量明顯升高，左側腎臟組織中CVF 和間充質標志物α-SMA 蛋白相對表達量明顯增高，上皮細胞標志物E-cadherin 蛋白相對表達量明顯減少，梗阻側腎臟組織出現RIF 典型的病理改變，提示模型制備成功，且在UUO 模型中EMT 過程已發生。

中醫學認為RIF 主要的發病機制在于濕熱濁毒內蘊，瘀血內阻，致腎失封藏［15］。濕熱之邪不僅可以損傷腎臟，更可阻滯經絡，影響血液在經脈中的運行，進一步加重瘀血病理改變［16］。血液流變學研究也證明濕邪較重的患者，其血液黏稠度較高［17］。而血流的緩慢和瘀滯會影響腎臟微循環中血液的正常灌流，引起微循環障礙，加重細胞損傷，致使ECM 沉積，纖維化加重［18］。由此可見：濕熱與瘀血在RIF 發病過程中起著非常重要的作用，二者相互影響，成為腎功能持續惡化的重要因素。有研究表明活血化瘀、清熱祛濕中藥可改善微循環，降低血液黏稠度，從而抑制成纖維細胞的轉分化，減少ECM 生成［19］。

筋骨草性寒味苦，具有清熱解毒、散瘀消腫的功效［20］，且苦能燥濕，故有助于改善RIF 狀況。本實驗結果顯示：筋骨草的有效成分TFA 干預后可明顯降低UUO 模型大鼠血清Scr、BUN 含量，改善患側腎臟組織病理損傷，并可明顯減少患側腎臟組織中ECM 積聚，減輕腎間質纖維化程度，提示TFA 具有保護腎功能的作用；中劑量TFA 還可明顯抑制UUO 模型大鼠腎臟組織中α-SMA 蛋白表達，減少E-cadherin 蛋白丟失，提示TFA 可通過抑制EMT 進展，延緩RIF 形成，從而發揮保護腎功能的作用。