LncRNA NUTM2A-AS1調控miR-183-5p/TGFα影響骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡的研究

崔國峰 劉丹 武軍龍 魏戎 劉瑞宇 王坤正*

1.西安交通大學附屬第二醫院骨與關節外科，陜西 西安 710004

2.鄭州大學附屬洛陽中心醫院骨科，河南 洛陽 471009

3.西安醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，陜西 西安710077

軟骨細胞凋亡及炎癥反應引起的軟骨損傷是導致骨關節炎(osteoarthritis，OA)形成的重要原因[1-2]。探討軟骨細胞凋亡在OA發生發展中的作用機制，可為OA的預防及早期治療提供理論基礎。轉化生長因子α(transforming growth factor α，TGFα)是一種與OA相關的生長因子，其通過抑制基質合成并促進分解代謝因子的表達在關節軟骨細胞中誘導OA樣表型，TGFα可能會成為未來OA治療的新靶點[3]。TGFα基因的rs2862851等位基因可顯著增加膝關節OA易感性風險[4-5]。生物學軟件預測發現TGFα與miR-183-5p有結合位點，miR-183-5p與LncRNA NUTM2A-AS1有結合位點。有研究[6]報道circ_DHRS3能夠通過競爭性靶向miR-183-5p正向調節GREM1表達，介導IL-1β作用的軟骨細胞增殖、凋亡和細胞外基質降解。沉默NUTM2A-AS1可減輕脂多糖誘導的牙髓細胞凋亡和炎癥[7]。然而NUTM2A-AS1對OA軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響及分子機制尚不清楚。白細胞介素-1β(IL-1β)在OA中起重要作用，可誘導軟骨細胞凋亡和炎癥反應[8]。本研究旨在探討NUTM2A-AS1對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響及其分子機制是否與調控miR-183-5p、TGFα有關。

1 材料與方法

1.1 材料

關節軟骨細胞(北京科瑞思搏生物科技有限公司)；DMEM培養基、白細胞介素-1β(IL-1β)(美國Sigma)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；細胞計數試劑盒8(CCK-8)、凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所)；RIPA蛋白裂解液、TNF-α、IL-6酶聯免疫試劑盒(艾美捷科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞處理與分組：將關節軟骨細胞用DMEM培養基培養，用5 μg/L的IL-1β處理軟骨細胞24 h，記為模型組，以正常培養的細胞作為對照組；將miR-183-5p、miR-NC、si-LncRNA NUTM2A-AS1、si-TGFα、si-NC分別轉染至軟骨細胞，后經IL-1β處理，記為miR-183-5p+模型組、miR-NC+模型組、si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組、si-TGFα+模型組、si-NC+模型組；將pcDNA-TGFα、pcDNA與si-LncRNA NUTM2A-AS1共轉染至軟骨細胞，后經IL-1β處理，記為pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組、pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組。

1.2.2RT-qPCR檢測LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平：提取各組細胞總RNA，合成cDNA后進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。PCR反應體系：2 μL反轉錄產物、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL，7 μL無菌水；循環條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.2.3蛋白質印跡法檢測蛋白表達：提取細胞總蛋白，取50 μL蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，后轉至PVDF膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入TGFα 、CyclinD1、Cleaved-caspase-3-抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；洗膜3次，顯影，定影，Quantity One測定蛋白條帶灰度值，以β-actin為參照計算其相對表達水平。

1.2.4CCK-8檢測細胞活性：將各組細胞接種于96孔板，培養48 h后每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm處吸光度值(A)。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡：收集各組細胞，用預冷的PBS漂洗2次，與500 μL的結合緩沖液混勻，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；最后上流式細胞儀檢測。

1.2.6酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平：各組細胞培養48 h后取上清，按照試劑盒操作檢測TNF-α、IL-6水平。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗：將LncRNA NUTM2A-AS1和TGFα的野生型、突變型熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC和miR-183-5p共轉染至軟骨細胞，按試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測各組細胞中LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平

與對照組比較，模型組LncRNA NUTM2A-AS1、TGFα mRNA表達升高(P<0.05)，miR-183-5p表達降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組LncRNA NUTM2A-AS1、TGFα mRNA表達降低(P<0.05)，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組TGFα mRNA表達降低(P<0.05)，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TGFα mRNA表達降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TGFα mRNA表達升高(P<0.05)，見表1。

表1 RT-qPCR檢測各組細胞中LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平Table 1 RT-qPCR was used to detect the expression levels of LncRNA NUTM2A-AS1, miR-183-5p and TGFα mRNA in each group of

2.2 蛋白質印跡法檢測各組細胞中蛋白表達

與對照組比較，模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達減少(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，見圖1和表2。

表2 Western Blot檢測各組細胞中蛋白表達Table 2 Western Blot was used to detect the protein expression in each group of

2.3 CCK-8檢測各處理組細胞活性

與對照組比較，模型組活性降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組活性升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組活性升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組活性升高(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組活性降低(P<0.05)，見表3。

2.4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

與對照組比較，模型組凋亡率升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組凋亡率升高(P<0.05)，見圖2和表3。

表3 CCK-8檢測各處理組細胞活性Table 3 CCK-8 was used to detect the cell viability of each treatment

2.5 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組細胞TNF-α、IL-6水平

與對照組比較，模型組TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)，見表5。

表5 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組細胞TNF-α、IL-6水平Table 5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of TNF-α and IL-6 in each group of

2.6 LncRNA NUTM2A-AS1通過miR-183-5p調控TGFα的表達

Starbase預測顯示LncRNA NUTM2A-AS1與miR-183-5p有結合位點，miR-183-5p與TGFα有結合位點(圖3A、3B)。LncRNA NUTM2A-AS1或TGFα野生型報告質粒與miR-183-5p共轉染后熒光素酶活性降低(P<0.05)，見表6、表7。與si-NC比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1組LncRNA NUTM2A-AS1和TGFα蛋白表達降低，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與si-LncRNA NUTM2A-AS1+anti-miR-NC比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+anti-miR-183-5p組miR-183-5p表達降低，TGFα蛋白表達升高(P<0.05)，見表8、圖3C。

表6 miR-183-5p與NUTM2A-AS1報告質粒共轉染后的細胞熒光素酶活性Table 6 Cellular luciferase activity after co-transfection of miR-183-5p with NUTM2A-AS1 reporter

表7 miR-183-5p與TGFα報告質粒共轉染后的細胞熒光素酶活性Table 7 Cellular luciferase activity after co-transfection of miR-183-5p with TGFα reporter n=9)

表8 LncRNA NUTM2A-AS1通過miR-183-5p調控TGFα的表達Table 8 LncRNA NUTM2A-AS1 regulates TGFα expression via n=9)

3 討論

OA是多種因素所致的炎性病癥，軟骨細胞凋亡可直接導致關節軟骨退變甚至鈣化；炎癥在關節軟骨退變過程中起重要驅動作用，其不僅引起軟骨組織細胞外基質降解，而且導致軟骨細胞凋亡[9-11]。因此，抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應對防治OA具有重要意義。已有研究[3-5]報道TGFα與OA的發生有關，TGFα基因的rs2862851等位基因影響漢族人群膝關節OA的易感性，且與其嚴重程度之間呈正相關。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中TGFα mRNA和蛋白表達水平升高，提示TGFα確實可能與OA進展有關。TNF-α、IL-6是促炎因子，其可促進炎癥反應，加重軟骨破壞損傷[12]；本研究發現低表達TGFα可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡，抑制TNF-α、IL-6水平，提高細胞活性，這表明低表達TGFα可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應，促進細胞存活，提示TGFα低表達可保護軟骨免受損傷。

為進一步研究TGFα上游可能的分子機制，本研究通過生物學軟件預測到TGFα是miR-183-5p的潛在靶基因。IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-183-5p低表達，提示miR-183-5p可能與軟骨細胞損傷有關。有研究[13]報道骨髓間充質干細胞的細胞外囊泡通過攜帶miR-183-5p改善腦神經功能，降低腦水含量并抑制炎癥反應。miR-183-5p通過負調節PTEN來減輕缺血性損傷[14]。miR-183-5p還通過減少凋亡細胞和降低凋亡相關蛋白水平來減輕心肌缺血/再灌注損傷[15]。說明miR-183-5p具有抑制細胞炎癥反應及損傷的作用。本研究發現，過表達miR-183-5p可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應，促進細胞存活，提示miR-183-5p可保護IL-1β誘導的軟骨細胞免受損傷。此外，本研究證實miR-183-5p可靶向調控TGFα，提示miR-183-5p可能通過調控TGFα影響關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應。

表4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況Table 4 Flow cytometry was used to detect cell apoptosis in each

研究[16-18]表明lncRNA參與OA的發病機制，可影響軟骨細胞的增殖、凋亡、炎癥和細胞外基質的降解。因此，本研究進一步預測miR-183-5p可能上游調控基因，發現miR-183-5p與LncRNA NUTM2A-AS1有結合位點。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中LncRNA NUTM2A-AS1表達水平升高，提示LncRNA NUTM2A-AS1可能與OA的進展有關。已有研究[7]表明沉默NUTM2A-AS1可減輕LPS誘導的牙髓細胞凋亡和炎癥。本研究轉染si-RNA來抑制NUTM2A-AS1表達，結果顯示低表達LncRNA NUTM2A-AS1可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應，促進細胞存活。

此外，本研究證實了LncRNA NUTM2A-AS1可靶向調控miR-183-5p，低表達LncRNA NUTM2A-AS1可下調TGFα的表達，且TGFα過表達可逆轉LncRNA NUTM2A-AS1低表達對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響，提示LncRNA NUTM2A-AS1可通過miR-183-5p進而調控TGFα表達影響軟骨細胞損傷。

綜上所述，低表達LncRNA NUTM2A-AS1能夠通過調控miR-183-5p/TGFα抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡及炎癥反應，促進細胞存活。