非編碼RNA在骨質疏松癥預測和防治中的作用研究進展

馬明領 董輝 楊斌 王永祥*

1.大連醫科大學研究生院，遼寧 大連 116044

2.揚州大學臨床醫學院，江蘇省蘇北人民醫院骨科，江蘇 揚州 225001

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的主要特點為骨組織微結構遭到破壞，骨小梁數量減少，骨脆性增加，在輕微外力作用下即可發生骨折[1]。骨質疏松癥分為原發性骨質疏松癥和繼發性骨質疏松癥，其中女性絕經后骨質疏松癥和老年性骨質疏松癥在原發性骨質疏松癥中較為多見。繼發性骨質疏松癥指繼發于某些其他疾病或服用某些藥物后引發的OP，比如糖尿病、甲亢、腎病等全身代謝性疾病或大量服用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物[2-3]。非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能編碼蛋白質、但卻具有極其重要的生物學功能的一類RNA。除轉運RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)外，非編碼RNA主要還包括：相對分子量較小的RNA如微小RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、環狀RNA(circRNA)、核內小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等以及相對分子量較大的長鏈非編碼RNA(lncRNA)[4-5]。這些非編碼RNA的功能及表達水平的失調，可引起各種疾病，其中包括骨質疏松癥[6]。近年來，越來越多的研究[7]表明非編碼RNA作為表觀遺傳調節劑，能夠在基因層面對OP的發生發展起到調控作用。本文將主要對circRNA、lncRNA、miRNA和siRNA在OP診斷和防治中的應用特點進行綜述。

1 circRNAs與骨質疏松癥

circRNA是非編碼RNA的一種，是新型共價閉合的環狀分子，數量較多且能夠在血液等體液中穩定存在，不易被核糖核酸酶(RNase)降解，在組織表達中特異性高[8]；對細胞生長和細胞信號轉導有著重要作用[9]。研究[10]證實circRNA可作為OP診斷的生物標志物和治療靶點，在OP預測和防治中發揮著重要作用。

1.1 circRNAs與骨形成

研究[11]發現 TNF-α通過抑制破骨細胞(osteoclast，OC)源性外泌體中的circRNA-circHmbox1的表達，進而抑制骨形成，circRNA-circHmbox1能夠靶向結合miRNA-1247-5P并抑制其表達，促進成骨細胞(osteoblast，OB)分化，促進骨形成。Wang等[12]通過體外細胞和體內研究發現在糖皮質激素性骨質疏松癥(GIOP)中，hsa-circRNA-0006393出現低表達，證實hsa-circRNA-0006393作為miR-145-5P的海綿，可通過直接靶向抑制miR-145-5P和上調FOX01的表達促進成骨細胞分化。circFOXP1在OP患者中的表達水平與非OP患者相比顯著降低，circFOXP1被證明可作為miR-33a-5P的海綿，靶向結合miR-33a-5P并抑制miR-33a-5P的表達，從而增強人脂肪源性間充質干細胞(hASCs)的成骨分化能力[13]。Lin等[14]研究發現 circ-SLC8A1在卵巢切除(OVX)小鼠中高表達，沉默circ-SLC8A1可增強miR-516b-5P的表達，circ-SLC8A1在胞質中發揮競爭性內源性RNA(ceRNAs)的作用，通過阻斷miR-516b-5P對AKAP2表達的抑制作用，以此抑制骨形成。另外Wen等[15]發現circRNA-0076906可誘導hMSCs的成骨分化作用，circRNA-0076906可作為miR-1305的海綿，與miR-1305靶向結合并抑制miR-1305的表達，而miR-1305又能夠負向調控靶基因Osteoglycin(OGN)的表達，研究證實circRNA-0076906可通過miR-1305/OGN通路促進hMSCs的成骨分化，從而延緩OP的進展。

1.2 circRNAs與骨吸收

核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和集落刺激因子1(CSF1)在破骨細胞的分化成熟中發揮著關鍵作用[16-17]。Chen等[18]發現在RANKL+CSF1處理的骨髓巨噬細胞(BMM)中，circRNA-2831表達上調，體內外circRNA-2831基因敲除后發現，BMM破骨細胞分化以及OVX小鼠骨吸收受到顯著抑制，研究表明circRNA-2831可作為ceRNA與miR-195a靶向結合，從而抑制miR-195a的表達，circRNA-2831/miR-195a/CSF1共同形成ceRNA網絡，調控OC分化和骨吸收。另外Liu等[19]研究發現circRNA-0007059和骨形態發生蛋白2(BMP2)在絕經后骨質疏松癥(PMOP)中表達下調，進一步研究發現circRNA-0007059作為miR-378的海綿，能夠靶向作用于miR-378；且發現BMP2的3′-UTR有miR-378的結合靶點，miR-378與BMP2靶向結合并對其發揮負性調控作用。circRNA對骨質疏松的調控作用主要是其能夠作為miRNA的海綿，通過與miRNA靶向結合進而調控miRNA的表達。同時circRNA能夠作為ceRNA,與miRNA、mRNA共同形成circRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡，從而使其能夠從基因層面調控骨形成與骨吸收。

2 lncRNAs與骨質疏松癥

lncRNA由大于200個核苷酸組成，其在結構上類似mRNA，但不具有編碼蛋白質的生物學功能[20]。lncRNA自2002年首次被發現以來[21]，雖最初被認為只是轉錄后的“副產物”，不具有生物學功能，甚至被認為是轉錄中的“噪音”，但近年研究證實lncRNA在表觀遺傳調控、細胞分化以及細胞周期等生命活動中發揮著重要作用[22]。lncRNA通過涉及miRNAs、mRNAs和蛋白質的不同機制來執行其功能[23-24]，在基因轉錄以及在轉錄后調節靶基因表達水平上，參與包括OP在內的機體疾病的發生與發展[25-26]。

2.1 lncRNAs與骨形成

研究[27]發現lncRNA CCAT1能夠與miR-34a-5P競爭性結合，阻止其靶基因MURF2的降解，從而抑制去卵巢大鼠OB的分化和增殖，因此研究提出可通過沉默lncRNA CCAT1防治骨質疏松癥。Yang等[28]發現lncRNA MEG3對骨代謝具有重要的調控作用，lncRNA MEG3能夠特異性地與miR-214結合，下調miR-214的表達，從而使TXNIP mRNA 表達上調，抑制OP大鼠成骨細胞分化、增殖能力，對骨質疏松癥具有正性調控作用。Che等[29]對OP小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)檢測發現lncRNA HCG18表達增加，miR-30a-5P表達降低；而在BMSCs向OB分化過程中，HCG18表達顯著降低，miR-30a-5P表達顯著提高，HCG18基因敲除則可進一步促進miR-30a-5p表達，研究證實HCG18通過miR-30a-5p/NOTCH1軸抑制BMSCs成骨分化作用,進而導致骨質疏松，可見lncRNA HCG18可能是BMSCs成骨分化的調節因子。Yin等[30]研究表明lncRNA AK039312和AK079370均可與miR-199B-5P靶向結合，增強GSK-3β mRNA表達，進而抑制Wnt/β-catenin通路，最終抑制OB分化和骨形成；miR-199B-5P作為OB分化的調節因子已被證實[31-32]，GSK-3β作為Wnt/β-catenin通路抑制劑，可使β-catenin磷酸化從而使其降解[33]。

2.2 lncRNAs與骨吸收

lncRNA參與成骨細胞分化、骨骼發育和骨骼疾病發生等過程[34-36]，然而關于lncRNA在體內破骨細胞形成過程中的作用信息有限。Liu等[37]通過RNA測序(RNA-seq)鑒定lncRNA在破骨細胞分化過程中的表達譜，發現1 117個lncRNA在OC中存在差異表達，其中表達上調的lncRNA 有699個，其余418個lncRNA表達下調，并發現lncRNA ENSG00 000 257 764.2-miR-106a-5p-TIMP2構成的ceRNA網絡可能對于OC的分化成熟作用顯著。Li等[38]研究證實LncRNA H19能夠與miR-29a-3P靶向結合，促進破骨細胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-10的表達，引起破骨細胞的增殖和凋亡，能夠參與OP的發生發展。Du等[39]研究發現在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL誘導的CD14+外周血單核細胞(PBMCs)向OC分化過程中，lncRNA TUG1表達顯著上調，且沉默TUG1表達發現抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性細胞數量減少、TRAP蛋白水平下降，而MafB蛋白水平增加，研究證實lncRNA TUG1在破骨細胞中過表達，并可與MafB靶向結合，對破骨細胞的成熟分化具有正向調節作用。另有研究發現lncRNA Nron對OC的形成具有調控作用，Nron的表達與破骨細胞的形成呈負相關，免疫熒光染色和Western blot結果證實，活化T細胞核因子1(NFATc1)蛋白可被Nron阻止進入破骨細胞核，影響OC的分化，抑制OC的形成[40]。lncRNA在真核生物的多種組織中廣泛表達，其能夠調節多種生理和病理過程,可通過檢測血液或其他可獲取組織中的lncRNA表達水平的變化為骨質疏松癥的早期診斷、治療及預后情況的評估提供一定的參考。

3 miRNAs與骨質疏松癥

miRNA是一種分子量較小的單鏈非編碼RNA，約由20～25個核苷酸組成。miRNA作為表觀遺傳調控因子，能夠與mRNA的3’-UTR靶向結合，具有選擇性的抑制、切割、降解內源性mRNA的作用，最終抑制靶基因的翻譯，改變其生物活性[41-42]。miRNA存在于各種生物中，可在基因層面調控細胞增殖、分化、凋亡等過程[43]。miRNA可以對機體中超過50 %的蛋白編碼基因進行調控[44]。

3.1 miRNAs與骨形成

最新一項研究[45]對120名絕經后女性進行基因檢測后發現OP組miR-206表達水平顯著低于正常對照組，并且miR-206在OP患者中的表達水平與骨密度(bone mineral density BMD)呈正相關，miR-206與組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)靶向結合調控OB的增殖、凋亡，影響骨形成，參與骨質疏松癥的發生發展。Li等[46]在小鼠原代OB中發現miR-2861，它被認為是一種新的miRNA，能夠靶向抑制HDAC5表達，促進骨形成；抑制miR-2861的表達后BMP2的表達隨之下降，而過表達miR-2861則會增強BMP2誘導的骨形成過程，可見miR-2861在骨形成過程中發揮著正向調控作用。Sun等[47]研究發現，miR-103-3p可通過直接靶向抑制m6A甲基轉移酶METTL4抑制骨形成，在OVX小鼠中治療性的抑制miR-103-3P的表達，發現骨形成減少，表明miR-103-3P/METTL14/m6A信號軸能夠有效調控骨形成過程。Wu等[48]發現miR-199a-3P通過與Kdm3a靶向結合并負向調控Kdm3a的表達，抑制成骨細胞分化，而Kdm3a能夠促進Erk2和Klf2 mRNA的表達，促進成骨細胞分化。Klf2能夠增強人骨髓基質細胞的自我更新能力，促進組織器官再生，Klf2通過與Runx2靶向結合在成骨細胞分化中發揮生理功能，當抑制Klf2的表達會對成骨細胞和破骨細胞產生相反的效應，前者分化能力減弱，后者分化能力增強[49-51]。

3.2 miRNAs與骨吸收

研究發現miRNAs可通過促進或抑制破骨細胞的分化來調控骨質疏松。Shen等[52]研究發現miR-128水平與OVX小鼠/PMOP患者骨標本和OVX小鼠原代BMMs中NFATc1水平升高呈正相關，而去乙酰化酶1 (SIRT1)是miR-128在OC分化過程中轉錄后水平的直接靶點，SIRT1水平的升高可抑制TNF-α和IL-1的表達，從而降低NF-κB的活性，在BMMs中過表達或抑制miR-128發現OC的生成顯著增加或減少，OC中miR-128的缺失能夠顯著抑制OVX觸發的OC生成，并對小鼠骨丟失起到保護作用，研究揭示了由miR-128/SIRT1/NF-κB信號軸介導的OC發生的關鍵機制，為PMOP的診斷和治療提供了可能的途徑。研究表明在OC介導的骨吸收過程中，RANKL、骨保護素(OPG)和CXCL12發揮著重要調控作用[53-54]。Lian等[55]發現 miR-29a通過調節RANKL和趨化因子CXCL12，抑制OC形成，miR-29a通過與RANKL靶向結合，抑制成骨細胞RANKL的分泌，從而有助于阻止OP的進展。另外Mizoguchi等[56]發現在RANKL刺激下，BMM的miR-31表達顯著增強，當抑制miR-31表達時，RANKL誘導的OC形成和骨吸收作用也受到抑制，研究發現miR-31主要是通過靶向結合RhoA并抑制其表達從而調控OC分化，進而調控骨吸收。miRNA作為表觀遺傳調控因子主要通過調控下游mRNA的表達進而調控成骨細胞介導的骨形成或破骨細胞介導的骨吸收，可針對miRNA的作用通路、miRNA的結合靶點或者對miRNA本身表達水平進行調控來阻止骨質疏松癥的進展。

4 siRNAs與骨質疏松癥

siRNA是由21～25個核苷酸組成的雙鏈RNA分子[57]，是由進入細胞后的雙鏈RNA(dsRNA)被RNaseⅢ家族中的Dicer切割形成[58]。目前siRNA主要通過RNA干擾技術(RNAi)應用于疾病的防治。RNAi 技術的原理主要是利用雙鏈 RNA降解細胞內同源信使RNA(mRNA)，從而阻斷特定基因表達[59-60]。siRNA需要與解旋酶、核酸內切酶等形成RNA介導的靜默復合物(RISC),且需要被RISC中的解旋酶解開成兩條單鏈，其中一條單鏈為反義鏈與同源mRNA特異結合，使mRNA沉默或降解[61]。siRNA所具有的理化特點(帶有負電荷、相對分子質量大、不穩定)決定siRNA需要與載體相結合才能被運送至靶細胞，目前siRNA主要與病毒載體或非病毒載體結合, 進行細胞感染或轉染，從而對特定基因進行調控[62]。

原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src參與多種細胞功能，有研究證實Src抑制OB分化，降低Src的表達后發現OB分化增強，骨形成能力增加；同時Src也可以通過調節破骨細胞骨架，提高OC分化能力，促進骨吸收[63-67]。Zheng等[68]建立類固醇相關性骨壞死(SAON)兔模型,之后將Src-siRNA、對照siRNA和生理鹽水髓內注射到股骨近端，誘導6周后通過顯微CT和組織學分析發現，對照組兔的股骨頭干骺端出現明顯的骨丟失，而注射了Src-siRNA的兔模型發現骨表面侵蝕減少，OC介導的骨吸收減少，證實siRNA敲除Src可減少骨吸收。Sezlev等[69]以陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)為復合材料制備聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)納米膠囊，將PEI:RANK siRNA復合物裝載至PLGA納米膠囊，并將其轉入小鼠巨噬細胞破骨前體細胞系RAW264.7，發現破骨前體細胞中的RANKL mRNA表達降低，并且研究結果顯示OC分化受到抑制，分化后的OC破骨活性降低，成熟OC的抗氧化活性明顯降低；此研究表明PEI:RANK siRNA復合物包裹在納米級PLGA膠囊中，有可能作為一種新的替代方法系統性地治療骨質疏松癥。CKIP-1是骨形成的負性調控因子，參與骨質疏松癥的發生[70]；Guo等[71]在體外篩選并鑒定了一個在人、恒河猴、大鼠和小鼠中具有高敲除效率的CKIP-1 siRNA序列即kipp-1 siRNA序列，通過實驗證實kipp-1 siRNA序列可促進體外跨物種成骨分化，促進健康小鼠骨形成，阻止骨吸收。

5 結語和展望

目前臨床對OP缺乏有效的預測和防控手段，針對OP的治療藥物主要是雙膦酸鹽類、降鈣素類、選擇性雌激素受體調節劑類(SERMs)、性激素補充劑、甲狀旁腺素類似物(PTHa)、氟化物、鍶鹽、中藥和中成藥以及近期在國內批準上市的地舒單抗(Denosumab)等藥物，目前以上治療藥物尚不能徹底預防和治療骨質疏松癥。非編碼RNA如circRNA、lncRNA、miRNA等能夠穩定地存在于血液等體液中，獲取及檢測方便。相信隨著研究的更加深入，非編碼RNA能夠作為OP預測、診斷的生物標志物及治療的新靶點，在OP的防治中得到有效的應用。