細胞焦亡對骨穩態的影響及展望

馬子健 馬明領 董輝 楊斌 王永祥

1.揚州大學臨床醫學院(蘇北人民醫院)骨科，江蘇 揚州 225001

2.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225009

3.大連醫科大學研究生院，遼寧 大連 116044

骨質疏松癥是常見的骨代謝性疾病，依賴于成骨細胞和破骨細胞作用的平衡，一旦失衡就會導致骨量流失、骨密度下降、骨脆性增加等問題，其后果便是骨折及其并發癥。常見的原發性骨質疏松見于老年性骨質疏松和絕經后骨質疏松，繼發性骨質疏松常見于糖皮質激素誘導的骨質疏松。骨質疏松是多因素造成的結果，結合早期對雌激素方面的研究，逐漸意識到炎癥與骨質疏松密切相關，雌激素與人體的免疫系統有多種聯系，并且雌激素可以減輕人體炎癥反應導致的骨流失[1-2]，氧化應激也可以從炎癥途徑影響骨代謝平衡[3]。細胞焦亡是一種炎癥相關的程序性細胞壞死，是人體的天然免疫屏障，當感染或者異常損傷時被激活，但目前還沒有研究報道細胞焦亡在骨代謝中的作用機制。本綜述主要結合最新研究進展，總結細胞焦亡的調控機制及其在骨質疏松方面的未來展望。

1 細胞焦亡

細胞焦亡是一種不同于凋亡和自噬的程序性死亡。早在2001年Boise等[4]總結前人經驗將這種炎性細胞死亡稱為“pyroptosis”—焦亡。其形態學特征是細胞發生腫脹，形成焦亡小體，細胞膜破裂，釋放炎癥因子。焦亡有經典途徑和非經典途徑。在經典途徑中，細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)可以識別病原體相關分子模式(pattern recognition receptors，PAMPs)或損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，常見的PAMPs有細菌脂多糖、病毒RNA[5]等，而DAMPs包括受損的蛋白質、植入物碎片[6]等。Nod樣受體(nod-like receptors，NLRs)作為焦亡途徑中的經典受體，含有NLRP家族蛋白，并參加炎癥小體的組裝，當其受到響應時，又將信號傳遞給下游的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD，ASC)，并且通過募集pro-caspase-1從而組裝成炎癥小體。最常研究的有NLRP3、AIM2等炎癥小體。募集的pro-caspase-1被剪切成有活性的caspase-1蛋白酶，也被稱為含有半胱氨酸的天冬氨酸水解酶，caspase家族蛋白在細胞凋亡途徑中尤為重要[7]，而在焦亡的經典途徑中最為重要的是caspase-1。激活的caspase-1不僅可以切割炎癥因子IL-1b和IL-18的前體促進其成熟，而且可以剪切效應蛋白gasdermin D(GSDMD)以暴露N-末端效應結構域。后者與細胞膜結合形成孔道，使細胞內的IL-1b和IL-18釋放，并募集周圍的炎癥因子，同時水及鈉離子進入細胞破壞正常的內外滲透壓平衡，導致細胞腫脹破裂，內容物釋放[8]。非經典途徑主要是細菌脂多糖(LPS)直接與caspase-4/11/15結合并激活炎癥小體及GSDMD誘導焦亡，與感染性疾病發生發展密切相關[9]。在經典途徑中最為主要的調控因子是NLRP炎癥小體及下游的炎癥因子，但有研究證明焦亡在骨關節炎起到重要作用，而且NLRP3也與骨代謝的通路密切相關[10]。

2 細胞焦亡在骨穩態中的探索

2.1 焦亡與破骨細胞

炎癥小體是是由受體蛋白NLR或ALR、接頭蛋白ACS及效應蛋白caspase組成的復合體。NLRP3炎癥小體的上調需要NF-kB通路來實現[11]，而NF-kB通路在破骨細胞活化中是最為經典的通路之一[12]。研究發現[13]，在破骨細胞中特異性表達Nlrp3D301 N的中，Nlrp3D301 N的高表達會導致骨量丟失，主要是由于NLRP3促成的IL-1b等炎癥因子發揮作用，進一步活化破骨細胞引起骨吸收作用。

引起骨質疏松的外界因素有空氣中的鎘等重金屬[14]，但Chen等[15]發現鋁誘導的骨丟失可以引起人體氧化應激和炎癥因子增加，并導致NLRP3的上調，但經煙酰胺單核苷酸處理后的小鼠血清中IL-1b、IL-18等炎癥因子顯著下降，ASC、caspase-1炎癥蛋白表達下降，從而減緩鋁誘導的骨損傷。在牙周炎這種感染性炎癥性疾病引起的骨吸收中，NLRP3能夠促進破骨細胞分化，并且通過敲除NLRP3基因，發現NLRP3缺失可使IL-1β釋放受阻并抑制破骨細胞分化[16]。但有研究發現[17]，通過細菌誘導炎癥的中，敲除NLRP3基因骨吸收程度并沒有降低，反而在caspase-1 KO的小鼠中骨吸收減弱，但是破骨細胞數量反而增加，提示caspase-1可能參與炎癥性骨吸收作用。

2.2 焦亡與成骨細胞

細胞焦亡與代謝性疾病如糖尿病密切相關[18]，而糖尿病引起的骨質疏松也被廣泛研究，胰島素缺乏及高血糖引起氧化應激可導致成骨細胞功能障礙[19]。Yang等[20]通過建立體內和體外糖尿病模型，通過檢測高糖環境中焦亡相關蛋白caspase-1、GSDMD的表達水平上升，證明了高糖可以激活牙槽骨成骨細胞的焦亡；并且使用capsase-1抑制劑可以使高糖對成骨細胞的增殖分化的抑制作用下降，從而證明了高糖可以通過焦亡途徑抑制牙槽骨成骨細胞的增值和分化。另外，研究發現[21]，通過糞腸桿菌感染成骨細胞MG63細胞，上調了caspase-1和NLRP3炎癥小體的表達，并使用caspase-1抑制劑處理和siRNA沉默NLRP3后，通過檢測細胞LDH釋放減少以此來說明以上處理導致焦亡減弱，說明NLRP3參與了糞腸桿菌誘導成骨細胞的焦亡途徑。而且Liu等[22]從LPS誘導成骨細胞氧化應激的角度證明了焦亡的存在，抑制焦亡可以增強成骨細胞的分化和活性。

3 NLRP3在骨穩態中的研究

作為經典的炎癥小體，NLRP3在炎癥性骨病中已被廣泛研究，如類風濕關節炎[23]、強直性脊柱炎[24]、骨髓炎[25]等。但是炎癥小體在焦亡通路中的作用機制尚未完善。炎癥小體的激活需要NF-kB通路以及有效激動劑如離子轉移、ROS等[18]。研究發現[26]，鳶尾素作為一種與運動相關的骨骼肌分泌物，與絕經后骨質疏松密切相關。經鳶尾素治療的OVX大鼠，通過檢測出抗氧化因子Nrf2蛋白高于骨質疏松組，而NLRP3表達相反；并且治療組中與凋亡相關的caspase-3和NLRP3表達下降及Runx2 成骨基因的mRNA水平顯著上調，成骨細胞凋亡減少，說明了鳶尾素能夠誘導Nrf2的上調，減少了成骨細胞的凋亡并且抑制NLRP3的表達。可見炎癥小體并不是細胞焦亡的專屬，其實細胞凋亡和焦亡之間存在交互關系。與凋亡相關的caspase-8能夠激活caspase-3切割Pannexin-1通道蛋白[27]，Pannexin-1促進鉀離子外排并開啟NLRP3的組裝[28]，caspase-8是調控細胞死亡方式的中間點，NLRP3·ASC炎癥小體可以募集caspase-8，若caspase-8有活性則激活下游的caspase-3引發凋亡，否則激活caspase-1引發焦亡[29-30]。與凋亡相關的caspase-3/8甚至可以直接作用于GSDMD家族蛋白引發焦亡，而GSDMD成孔效應的延遲則可能使焦亡轉化為凋亡。有研究表明[31]，通過脂多糖或軟脂酸激活間充質干細胞中的NLRP3炎性小體發現成骨分化減弱，脂肪分化加強，并且通過抑制下游效應蛋白caspase-1，可以抑制這種成脂分化和輕度改善成骨效應。Xu等[32]通過建立OVX，發現褪黑素能夠抑制NLRP3在成骨細胞中的表達，并且改善了NLRP3對骨髓間充質干細胞胞向成骨分化的抑制作用。還有研究表明骨基質成分可以作為DAMPS激活NLRP3的表達來刺激破骨細胞的分化，從而維持骨吸收過程[33]?？偨Y多項研究可以看出炎癥小體在骨穩態中的作用正在不斷被挖掘，但是很多研究未能真正將細胞焦亡與骨穩態和骨質疏松疾病聯系起來，而只是停留在炎癥小體的研究上，很大程度上是細胞焦亡的機制還沒有被完全解釋清楚，以及細胞焦亡與凋亡等其他細胞死亡方式是否存在密切關系，這些都有待進一步研究。

4 IL-1b、IL-18相關作用

作為焦亡途徑的下游信號，IL-1b和IL-18是關鍵的炎癥因子，也是焦亡發生的效應物質。IL-1b和IL-18同屬于IL-1家族成員，具有相似的信號傳導通路[34]，兩者經caspase-1切割后暴露活性，引起級聯炎癥反應。早已被證明骨關節炎、類風濕關節炎等炎癥性骨病與IL-1b、IL-18等炎癥因子密切相關，如IL-1b、IL-18骨關節炎患者的關節液中表達過高[35-36]，而這些炎癥性骨病甚至會導致骨密度降低、骨穩態紊亂，繼而引發骨質疏松[37]。IL-1b和IL18也有相互促進分泌的作用[38]。

IL-1b骨折愈合的重要因素之一[39]?？傮w來說IL-1b在骨穩態的作用是促進骨吸收，IL-1b通過上調RANKL及招募巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)來促進破骨細胞前體的分化和成熟[40-41]，并且增強破骨細胞的活性。Zhuang等[42]在構建小鼠牙周炎模型中通過誘導M2型抗炎巨噬細胞，發現IL-1RA(白細胞介素1受體拮抗劑)mRNA表達升高，RANKL表達下降，并降低了破骨細胞的活性。并且另一研究證明IL-1RA缺陷會增加破骨細胞的形成[43]。當IL-1b與相應受體結合后，引起下游NF-kB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、活化蛋白-1(AP-1)等多種因子上調，啟動c-Fos信號，從而導致破骨細胞相關基因轉錄[44-45]，阿托伐他汀則可以抑制IL-1b引起的NF-kB和MAPK信號，從而抑制破骨細胞分化[46]。另外，IL-1b似乎與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)密切相關，早在許多年前就有這方面的研究，極低濃度的IL-1b和TNF-α可以協同刺激破骨細胞生成[47]，TNF-α是公認的破骨細胞相關因子，降鈣素基因相關肽可以抑制IL-1b和脂多糖刺激成骨細胞產生TNF-α，并間接降低破骨活性[48]。而且IL-1可以抑制成骨細胞產生的骨保護素(OPG)，間接增強了破骨活性[49]，但García-Lpez等[50]從機械應力的角度發現在體外培養的成骨細胞上清液中IL-1b、TNF-α等破骨相關因子上調的同時，OPG也隨之上調，說明細胞因子對成骨細胞具有多通路影響。

而IL-18對骨穩態的作用相對復雜。早期研究證明，IL-12和IL-18可以協同抑制破骨細胞活性，但二者均不能直接作用于破骨前體細胞[51]。而IL-18可以促進骨髓間充質干細胞的成骨分化[52]。IL-18可由T淋巴細胞、自然殺傷細胞等分泌，也有研究證明成骨細胞也具備分泌IL-18的能力[53]。有研究表明[54]，IL-18 可以調節體內成骨細胞的骨合成代謝，并且受甲狀旁腺素的調控。IL-18可以從以下幾個方面來影響人體的骨代謝平衡：(1)IL-18通過作用于T細胞釋放粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，從而抑制破骨細胞活性[55]；(2)IL-18通過作用于T細胞和單核巨噬細胞產生TNF-α，從而間接刺激破骨細胞活性[56]；(3)IL-18和IL-12協同通過作用于輔助性T細胞產生IFN-γ(interferon-γ)，一方面可以下調RANKL，抑制RANK信號傳導，并且抑制TNF-α誘導的破骨細胞分化；但另一方面，IFN-γ通過作用于T細胞分泌破骨因子RANKL和TNF-α，并且在病理條件下又可以激活破骨細胞[57-59]。

5 總結與展望

細胞焦亡作為一種新型的炎癥性程序性死亡，與傳統的凋亡和壞死既有區別又有共性，焦亡相關蛋白的研究正在廣泛地進行，關于焦亡還有很多需要探索，比如細胞焦亡是否具有自我調節機制，從而避免焦亡過度激活造成組織損傷，以及GSDMD成孔效應是否受到細胞內外環境的調控。而目前研究細胞焦亡在骨穩態中的影響，無論是對成骨細胞還是破骨細胞，往往研究的是焦亡引起的炎癥因子IL-1b和IL-18對二者的影響，NLRP3炎癥小體、caspase蛋白家族以及IL-1b和IL-18可以作為治療骨質疏松的靶點，但仍要思考的是一方面能否給出成骨細胞和破骨細胞焦亡的形態學證據，以及要證明在發生骨質疏松常見的部位如股骨、腰椎等是否有焦亡的存在；另一方面，焦亡相關蛋白是否可以參與已研究的成骨細胞和破骨細胞通路，如OPG/RANKL/RANK、Wnt/β-catenin等，這些都有待進一步研究。