GCM1通過激活Wnt3a/β-catenin信號通路改善絕經后骨質疏松癥

謝菲飛 宋立穩 王小英 胡燕芳 謝蘊云 劉文華 謝寶強*

1. 廣東省人民醫院贛州醫院(贛州市立醫院)內分泌代謝科，江西 贛州 341000

2. 濰坊市人民醫院內分泌代謝科，山東 濰坊 261000

骨質疏松癥是最常見的骨骼疾病之一，其特點是骨微結構發生改變、骨密度降低和脆性骨折風險增加[1]。據估計[2]，全球50歲以上人群中，約有40 %絕經后女性、20 %男性患有骨質疏松癥。絕經后婦女的發病率要比同齡男性高6倍，其原因是絕經后卵巢功能衰退、雌激素水平下降，甲狀旁腺素(PTH)導致骨吸收增強，成骨細胞的増殖和分化受到抑制，使骨吸收大于骨形成，從而導致骨密度降低，易發生骨折[3-4]。前期研究中發現GCM1在絕經后骨質疏松癥(PMO)患者血清中低表達，但是關于GCM1在PMO中的作用和分子機制還尚未有研究報道。有研究發現GCM1能夠促進星形膠質細胞和胚胎滋養層細胞的分化[5-6]，揭示其具有促進成骨細胞分化的潛力。本研究擬通過觀察GCM1對MC3T3-E1細胞增殖、分化及礦化的影響及具體的作用機制，為PMO的治療提供新的思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)購自中國科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；α-MEM培養基、胎牛血清(FBS)、TRIzolRNA分離試劑、逆轉錄試劑盒、SYBRGreen均購自ThermoFisherScientific(中國)；RIPA裂解緩沖液購自北京碧云天生物科技有限公司；堿性磷酸酶(ALP)染液購自南京建成生物工程研究所；GCM1兔多抗、GAPDH兔多抗購自proteintech；RUNX2兔單抗、Osterix兔單抗、Ostopontin兔單抗、CollagenI兔單抗、Wnt3a兔單抗、β-Catenin以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白IgG二抗均購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分化：將MC3T3-E1細胞在含10 % FBS的α-MEM培養基中于37 ℃、含5 % CO2的條件下培養，當細胞密度達到80 %時，進行傳代培養。細胞成骨分化培養：將MC3T3-E1細胞在分化培養基(DM)培養基中培養，并添加10 %胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸、4 mmol/L β-甘油磷酸酯和BMP2(300 ng/mL)，每三天更換一次，培養14 d[7]。

1.2.2細胞轉染：GCM1過表達載體(pcDNA-GCM1)及其陰性對照(pcDNA-NC)和GCM1干擾序列(sh-GCM1)及其陰性對照(sh-NC)由廣州銳博生物科技有限公司合成。根據脂質體LipofectamineTM2000制造商的使用說明書將GCM1過表達載體和GCM1干擾序列及其陰性對照轉染至各自細胞組：Ov-NC組、Ov-GCM1組、Sh-NC組以及Sh-GCM1組，并通過qRT-PCR和Western blot檢測轉染效率。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)定量分析：根據制造商的使用說明書，使用TRIzolRNA分離試劑從各組細胞中分離提取總RNA。通過逆轉錄試劑盒合成cDNA，使用SYBRGreen進行qRT-PCR定量分析。以GAPDH為內參進行歸一化處理，并用2-ΔΔCt值計算目的基因相對表達水平。所用引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 The primer sequence of qRT-PCR

1.2.4蛋白質免疫印跡(Western Blot)檢測：將各處理組細胞以2×106個/孔接種在6孔板中，并在實驗前培養24 h。收集轉染后的各組細胞并在冰上用預冷的RIPA裂解緩沖液裂解10 min，收集總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量分析。取50 μg總蛋白使用SDS-PAGE在100 V條件下電泳1 h。隨后，在60 V的條件下電轉2 h將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下用5 %脫脂牛奶對膜封閉處理2 h，4 ℃下與一抗孵育過夜。將膜用含0.1 %Tween 20的PBS洗滌3次(每次10 min)在室溫下和二抗一起孵育2 h。免疫印跡用增強的化學發光試劑(ECL)顯色，并拍照觀察。

1.2.5堿性磷酸酶(ALP)染色檢測：在細胞成骨誘導14 d后，棄去培養皿中的誘導液，PBS洗滌3次，室溫下在4 %多聚甲醛中固定30 min，棄去固定液，PBS洗滌3次。加入適量新鮮配置的底物應用液，在濕盒中避光孵育15 min后，水洗2 min。趁濕用復染液復染30 s，蒸餾水洗1 min，甩干，在倒置光學顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6茜素紅染色：細胞誘導培養21 d后，棄去培養皿中的誘導液，PBS洗滌3次，在95 %乙醇中固定10 min，再用PBS洗1～2次，用含0.1 %茜素紅溶液染色10 min。最后用PBS沖洗，在倒置光學顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統計學分析

所有實驗均進行3次平行實驗，并用GraphPad Prism8.0進行統計學分析，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05被認為差異具有統計學意義(雙尾)。

2 結果

2.1 GCM1在PMO患者血清中低表達

在GEO數據庫中獲取并下載絕經后骨質疏松癥患者芯片GSE56116數據(包括3例正常、10例PMO患者)，GEO2R分析發現GCM1在PMO患者血清中低表達(圖1A)。如圖1B、1C所示：Western Blot和qRT-PCR實驗發現轉染pcDNA-GCM1使MC3T3-E1細胞中GCM1表達升高(P<0.001)，而轉染sh-GCM1后GCM1表達降低(P<0.001)。

2.2 GCM1促進BMP2誘導MC3T3-E1細胞成骨分化

RT-qPCR檢測MC3T3-E1成骨分化過程中GCM1的相對表達情況，發現GCM1隨著誘導成骨分化時間遞增(圖2A)。ALP是成骨分化的標志物，ALP染色實驗發現(圖2B)，和control組相比，BMP2誘導組ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組ALP含量降低(P<0.001)。進一步通過Western Blot檢測成骨分化相關基因(RUNX2、Osterix、Ostopontin、CollagenⅠ)的表達水平，結果如圖2C所示，和control組相比，BMP2誘導組成骨分化相關基因表達增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組成骨分化相關基因表達增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組成骨分化相關基因表達降低(P<0.001)。RT-qPCR檢測發現成骨分化相關基因mRNA表達水平與Western Blot結果保持一致(圖2 D，P<0.001)，表明GCM1促進了BMP2誘導MC3T3-E1細胞成骨分化，而抑制GCM1表達則抑制了BMP2誘導MC3T3-E1細胞成骨分化。

2.3 GCM1促進MC3T3-E1細胞礦化

通過茜素紅染色觀察MC3T3-E1細胞礦化情況，結果如圖3所示：和control組相比，BMP2誘導組成鈣化結節面積增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組鈣化結節面積增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組鈣化結節面積降低(P<0.001)。表明GCM1促進BMP2誘導MC3T3-E1細胞礦化，而抑制GCM1表達則抑制了BMP2誘導MC3T3-E1細胞礦化。

2.4 GCM1激活Wnt3a/β-catenin信號

通過Western Blot和RT-qPCR檢測Wnt3a/β-catenin信號水平變化，結果如圖4所示：和control組相比，BMP2誘導組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達水平增加(P均<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達水平增加(P均<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達水平降低(P均<0.01)。表明GCM1在BMP2誘導MC3T3-E1細胞成骨分化過程中激活Wnt3a/β-catenin信號。

3 討論

絕經后骨質疏松癥(PMO)引起的疼痛和骨骼變形等癥狀均嚴重影響并困擾女性患者的生活及工作，帶來的后果也給家庭和社會造成了負擔，因此探究絕經后骨質疏松癥的發生、發展機制并為PMO治療提供新的思路具有重要意義。

GEO數據庫包含全球各地研究者上傳的各種高通量測序數據，在本研究篩選出的GSE56116芯片(包括3例正常、10例PMO患者)中，發現GCM1在絕經后骨質疏松癥患者的血清中低表達。多項研究[8-9]發現GCM1能夠促進胎盤滋養層細胞分化，但是關于其在絕經后骨質疏松癥中的作用機制還尚未有研究報道。在骨質疏松癥患者中增加骨形成，促進成骨細胞分化和礦化，促使骨形成大于骨吸收，能夠有效緩解骨質疏松癥[10]。本研究發現在誘導MC3T3-E1細胞成骨分化的過程中，GCM1表達逐漸增加，暗示GCM1與MC3T3-E1細胞成骨分化的進程相關。ALP是成骨細胞中的關鍵標記基因，在早期成骨中起關鍵作用，能夠水解各類磷酸鹽促進細胞成熟和鈣化[11]。在成骨分化后期，轉錄因子RUNX2、Osterix促進細胞產生骨基質[12]，Ostopontin、Collagen Ⅰ在成骨分化過程中逐漸合成，促進細胞附著并刺激成骨細胞分化[13-14]。本研究通過ALP染色和Western Blot發現過表達GCM1能夠促進ALP表達以及成骨相關蛋白的表達，而抑制GCM1表達則抑制了ALP表達以及成骨相關蛋白的表達。上述實驗證實GCM1能夠促進BMP2誘導MC3T3-E1細胞成骨分化。茜素紅能夠與鈣發生顯色反應，產生一種深紅色的化合物，從而能夠檢測到成骨誘導的細胞外面沉積的鈣化結節，進而用來鑒定細胞株的成骨分化[15]。本研究通過茜素紅染色發現過表達GCM1促進MC3T3-E1細胞礦化，而抑制GCM1表達則抑制MC3T3-E1細胞礦化。

Wnt/b-catenin信號通路在調控胚胎發育、細胞增殖以及成骨分化和骨形成過程中發揮重要作用[16-18]。多項研究[19]發現激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進細胞成骨分化，緩解骨質疏松癥。如敲除Foxf1基因激活Wnt/β-catenin信號通路，促進骨髓間充質干細胞成骨分化，防止卵巢切除引起的骨丟失[20]；植物雌激素通過上調Wnt/β-catenin信號通路來預防去卵巢大鼠的骨質疏松癥[21]。此外，還有研究[22]發現Preptin通過上調β-catenin表達促進MC3T3-E1細胞的增殖和成骨;熊果苷通過Wnt/β-catenin信號通路促進MC3T3-E1小鼠成骨前體細胞增殖和分化[23]。脫鹽鴨蛋蛋白肽通過上調Wnt3a表達，激活Wnt/beta-catenin信號通路促進MC3T3-E1細胞成骨分化[24]。這些研究均表明激活Wnt/β-catenin信號通路在PMO的治療中具有重要價值。本研究發現過表達GCM1可以上調Wnt3a、β-catenin的表達水平，而抑制GCM1表達則抑制了Wnt3a、β-catenin的表達，表明GCM1在MC3T3-E1成骨分化的過程中能夠激活Wnt3a/β-catenin信號通路，暗示GCM1具有治療PMO的潛在價值。

總之，本研究發現GCM1在PMO患者血清中低表達，過表達GCM1能夠通過激活Wnt3a/β-catenin信號通路促進MC3T3-E1細胞的成骨分化和礦化，改善絕經后骨質疏松癥，為PMO患者的治療提供新的思路和治療方向。