益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝的影響

劉蔚楠 周曉霞 朱瑋 章靚 林家鐘 林翔 王榮茂 張燕 戴燕鈴

1.福建中醫藥大學附屬人民醫院骨傷科，福建 福州 350004

2.福建中醫藥大學附屬人民醫院藥學部，福建 福州 350004

3.中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室(福建中醫藥大學)，福建 福州 350122

4.福建中醫藥大學護理學院，福建 福州 350122

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種與增齡相關的疾病，絕經后女性由于雌激素水平迅速下降，成骨與破骨間的動態平衡被打破，出現骨量減少及骨組織結構變化，從而導致PMOP的發生[1]。目前我國人口老齡化日趨嚴重，是世界上老年人口最多的國家，PMOP已成為我國面臨的重要公共健康問題。它會引起全身慢性疼痛、多部位的脆性骨折甚至死亡，嚴重影響了老年人的生活質量，給個人、家庭和社會帶來了沉重的精神和經濟負擔。目前PMOP的臨床用藥以西藥為主、中藥為輔，西醫治療用藥主要包括激素替代療法(HRT)、雙膦酸鹽、降鈣素等。西藥在治療上雖有規范明確的指南，但不少藥物都有明顯的副作用，如惡心嘔吐、頭暈乏力、胃腸道不適、激素依賴性腫瘤等，停藥后骨量會隨之迅速下降[2-5]。

近年來，中醫藥在防治PMOP方面積累了豐富的臨床實踐經驗，且多數學者[6]認為中藥通過對機體多途徑、多通路、多靶點的調節，取得了較為肯定的療效，實現標本同治，在防治PMOP領域具有巨大的潛力。本團隊前期臨床研究[7-8]表明，益腎健骨膏能夠有效減輕PMOP患者的疼痛，提高腰椎骨密度，降低Ⅰ型膠原蛋白C端肽水平，且未出現胃腸道不良反應，但其相關作用機制尚不明確。因此，本研究擬用益腎健骨膏干預去勢大鼠，探討益腎健骨膏對改善PMOP骨密度和骨代謝的效果及其潛在作用機制，為臨床應用提供進一步的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：清潔級雌性SD大鼠50只，3月齡，體重(250±20)g，購自福建醫科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(閩)2016-0002，飼養于福建省中醫藥科學院比較醫學中心，溫度22 ℃～24 ℃，濕度40 %～70 %，每日人工光源12 h明暗交替。本實驗經福建省中醫藥研究院動物倫理委員會批準(批號：FJATCM-IAEC2020004)

1.1.2藥品：阿侖膦酸鈉維D3購自石藥集團歐意藥業有限公司，批號271190202；注射用青霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司，批號10122008163；益腎健骨膏(批號：200727)，由福建中醫藥大學附屬人民醫院制劑室提供，主要組成：杜仲、淫羊藿、菟絲子、黃精、骨碎補、當歸、熟地、巴戟天、補骨脂、枸杞、山藥等，水煎過濾，濃縮至500 mL藥液(每毫升相當于1.3 g原生藥的藥液)，即高劑量膏方組濃度。低劑量膏方組取益腎健骨膏藥液100 mL加水稀釋至600 mL(每毫升相當于0.2 g原生藥的藥液)。

1.1.3主要試劑和儀器：主要試劑：戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號AM00469)，RNA提取液(Thermo，貨號15596026)，反轉錄試劑盒(近岸蛋白質科技有限公司，貨號E047-01B)，QPCR試劑盒(近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01A)，Notch1 (D1E11) XP Rabbit mAb(CST公司，貨號3608)，Notch2 (D76A6) XP Rabbit mAb(CST公司，貨號5732)，Jagged2 (C23D2) Rabbit mAb(CST公司，貨號2210)，Jagged1 Polyclonal Antibody(immunoway公司，貨號YT6212)，耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨保護素(OPG)、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型膠原交聯羧基端肽(CTX-Ⅰ)檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，貨號: SEA902Ra、SEA108Ra、CEA957Ra、CEA665Ra)；主要儀器：雙能X射線骨密度儀(美國HOLOGIC，型號：DISCOVERY W型)、熒光定量PCR儀(ABI公司，型號：Stepone plus)、(450±10)nm濾光片的酶標儀(BioTek公司，型號ELx808)、萬能材料試驗機(日本島津公司IG-A1000 N)。

1.2 方法

1.2.1動物造模及分組、給藥：50只3月齡雌性SD大鼠喂養2個月后，隨機分為假手術組、模型組、高劑量膏方組、低劑量膏方組、陽性藥物組,每組10只。禁食12 h后經大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，假手術組大鼠暴露卵巢但不切除，其余各組大鼠采用一次性切除雙側卵巢的方法造模[9]，術后連續3 d給予8萬U青霉素預防感染。造模成功后，假手術組、模型組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，低、高劑量膏方組分別給予2 g/(kg·d)、13 g/(kg·d)益腎健骨膏灌胃，陽性藥物組灌服6.25 mg/(kg·w)阿倫膦酸鈉維D3片[10]，各組均持續干預12周。每周記錄大鼠的體重，根據體重調整灌胃量。實驗結束時，假手術組死亡1只，其他組大鼠均存活。

1.2.2取材：干預12周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，用2 %戊巴比妥鈉(45 mg/kg)經大鼠腹腔注射麻醉后，取腹主動脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，取血清，保存于-80 ℃冰箱備用。分離大鼠L4、L5腰椎，用生理鹽水濕潤的紗布包裹，外層再予錫紙包好后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3大鼠腰椎骨密度、最大壓縮載荷測定：采用骨密度儀檢測腰椎L4的骨密度，選擇高分辨模式，行間距0.07 cm，點分辨率為0.062 2 cm，6.10×0.10 Coll，140/100 kVp。萬能材料試驗機對腰椎L4進行椎體壓縮(加載速度為1 mm/min)，記錄最大壓縮載荷。

1.2.4血清骨代謝指標檢測：大鼠腹主動脈采血，以3 000 r/min離心15 min，取上層血清，Elisa法檢測血清TRACP、OPG、PINP，CTX-Ⅰ水平。

1.2.5PCR法檢測Notch通路及OPG/RANKL/RANK系統的基因表達：用液氮研磨凍存的大鼠L5腰椎組織，按照試劑盒依次提取總RNA，反轉錄及擴增，實時熒光定量PCR法檢測OPG、RANKL、RANK、TRAF 6、Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的 mRNA表達。引物由福州尚亞生物技術有限公司合成，詳見表1。DNA擴增條件：95 ℃預變性10 min后進入PCR循環，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環。結果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.6Westbern blot檢測骨組織Notch通路的蛋白表達：將50 mg腰椎組織加入液氮研磨，提取總蛋白，上樣電泳后轉至PVDF膜上，室溫封閉2 h，分別加入稀釋的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2一抗(1∶1 000), 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后3次,加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜后,ECL顯影曝光，Photoshop整理去色，Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠腰椎最大壓縮載荷及骨密度的影響

與假手術組比較,模型組大鼠腰椎壓縮最大載荷及骨密度顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組腰椎壓縮最大載荷及骨密度變化無統計學意義(P>0.05)，而高劑量膏方組和陽性藥物組顯著升高(P<0.05)，高劑量膏方組和陽性藥物組在腰椎壓縮最大載荷及骨密度方面接近，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 各組大鼠腰椎壓縮最大載荷及骨密度Table 2 The maximum compressive load of lumbar spine and bone mineral density of the rats in each group

2.2 益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝標志物的影響

與假手術組相比,模型組大鼠TRACP、CTX-Ⅰ水平顯著升高，而PINP、OPG水平顯著降低(P<0.05)；治療3個月后，與模型組比較，低劑量膏方組骨代謝物水平無明顯變化(P>0.05)，而高劑量膏方組和陽性藥物組TRACP、CTX-Ⅰ水平顯著降低，而PINP、OPG水平顯著升高(P<0.05)；高劑量膏方組和陽性藥物組TRACP和OPG水平無明顯差異(P>0.05)，高劑量膏方組CTX-Ⅰ水平高于陽性藥物組，而PINP低于陽性藥物組(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血清PINP、OPG、TRACP、CTX-Ⅰ水平Table 3 The serum levels of PINP, OPG, TRACP and CTX-Ⅰ in each

2.3 益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織Notch通路的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腰椎Notch 1、Notch 2及其配體Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組、高劑量膏方組和陽性藥物組Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，見表4和圖2。

表4 各組大鼠Notch 1、Notch 2、Jagged 1 and Jagged 2基因表達Table 4 Relative mRNA levels of Notch 1, Notch 2, Jagged 1 and Jagged 2 in each

2.4 益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠OPG/RANKL/RANK系統基因表達的影響

與假手術組比較,模型組大鼠腰椎OPG的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組OPG的mRNA表達無明顯變化(P>0.05)，RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，高劑量膏方組和陽性藥物組腰椎OPG的mRNA表達顯著增加(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與高劑量膏方組比較，陽性藥物組腰椎OPG的mRNA表達顯著增加(P<0.05)，RANKL、RANK的mRNA表達無顯著差異(P>0.05)，下游TRAF 6的mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠OPG/RANKL/RANK系統基因表達Table 5 Relative mRNA expression levels of OPG/RANKL/RANK in each

3 討論

中醫學將絕經后骨質疏松癥歸屬為“骨痿”范疇，主要是由于絕經后女性腎精不足導致骨失滋養的全身性慢性骨骼疾病。中醫認為，PMOP的關鍵病機以腎精虧虛為主，兼顧脾虛和血瘀，臨床治療以“改善臨床癥狀，延緩骨量丟失，或增加骨量，降低骨折風險，提高生存質量”為目的，遵循補腎益精、健脾益氣、活血祛瘀的基本治則[6]。近年來研究[11]顯示，中藥治療PMOP主要表現為類雌激素樣作用，能有效提高雌激素，抑制骨吸收，促進骨形成，從而達到防治PMOP的療效。目前療效較為明確的單味中藥包括杜仲、骨碎補、淫羊藿、補骨脂、葛根、丹參等，中成藥有左歸丸、金天格膠囊(肝腎陰虛證)，右歸丸、仙靈骨葆膠囊(脾腎陽虛證)，骨疏康顆粒/膠囊、壯骨止痛膠囊(腎虛血瘀證)[6,12]。流行病學調查[13]顯示，PMOP的中醫證型腎虛證高達84.7 %，治療PMOP的藥物歸經主要以肝腎居首。近年來多項系統評價[14-16]顯示補腎法是治療PMOP的根本大法，補腎中藥可以改善PMOP患者的VAS評分、骨密度、骨代謝以及脆性骨折發生率等指標，其臨床療效確切，且無不良事件。

益腎健骨膏為福建中醫藥大學附屬人民醫院治療骨質疏松癥的經驗方，現已作為協定成方廣泛應用于臨床。益腎健骨膏以“補益肝腎、活血化瘀”為組方原則，方中杜仲、續斷、骨碎補、巴戟天具有補肝腎、強筋骨的作用，加用菟絲子、山茱萸、枸杞、黃精可增強補益肝腎的作用，佐以當歸、熟地、丹參、牛膝可活血化瘀、益精填髓。益腎健骨膏諸藥合用共奏補益肝腎、強筋壯骨、活血通絡之效，使骨有所充、髓有所化、筋有所養。且“滋膏”的劑型是治療慢性疾患的最佳劑型，適合PMOP患者長期滋補服用。本研究結果表明，高劑量的益腎健骨膏可以顯著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨強度及骨形成指標，且降低骨吸收指標水平，與前期臨床研究結果一致，再次證實益腎健骨膏在調節PMOP骨代謝水平，促進骨重建方面的顯著療效。

Notch信號通路骨代謝和骨重建方面發揮著關鍵作用, 可影響成骨細胞和破骨細胞的分化和平衡，是治療絕經后骨質疏松癥的新靶點[17-18]。Canalis E[19]的研究表明，骨細胞中Notch1表達顯著增加了小鼠血清OPG的含量，以抑制骨吸收引起骨量的增加。多項中醫補腎方干預PMOP大鼠后顯示，對Notch通路的Notch 1、Jagged 1、HES蛋白表達起正向調節作用,促進骨形成,改善了PMOP的癥狀[20-22]。本研究顯示，PMOP模型大鼠的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA、蛋白表達均顯著降低，益腎健骨膏治療后，上述基因的mRNA、蛋白表達顯著升高，說明益腎健骨膏可能通過影響Notch通路，促進骨形成，抑制骨吸收，進而減少骨量丟失。

OPG/RANKL/RANK軸與PMOP的發生密切相關，它是雌激素受體激活通路的下游信號通路，OPG是抑制骨吸收、增加骨密度和骨強度的關鍵細胞因子。OPG與RANKL分別作用于OC和OB，OPG通過與RANK競爭性地結合RANKL起到調控骨代謝信號通路的作用。若OPG/RANKL/RANK信號表達失衡，則破骨活性增強，形成負性骨平衡狀態而導致PMOP的發生[23-24]。高城翰等[14]的Meta分析表明補腎法在調節PMOP動物模型的OPG/RANK/RANKL信號通路方面具有重要優勢。本研究結果顯示，PMOP模型大鼠腰椎OPG的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達顯著增加，而高劑量益腎健骨膏干預后，大鼠腰椎OPG的mRNA表達顯著增加，同時RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達降低，提示益腎健骨膏可能通過OPG/RANKL/RANK軸抑制了骨吸收，減少骨量丟失。

綜上所述，基于“補益肝腎、活血化瘀”治療原則組方的益腎健骨膏，能夠有效增強去卵巢骨質疏松大鼠的骨密度和骨強度，調節骨形成和骨吸收的代謝平衡，其作用機制可能與干預了Notch通路及OPG/RANKL/RANK系統密切相關，為臨床應用提供了進一步的理論支持。