健骨膠囊對成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1增殖及分化作用機(jī)制

賈玉巖 周振薇 王旭凱 楊宇安 劉茜 幺寶金* 冷向陽*

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117

2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117

3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，吉林 長春 130021

4.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院繼續(xù)教育學(xué)院，吉林 長春 130117

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種慢性骨病，其特征是骨骼的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致骨質(zhì)減少和脆弱骨折的風(fēng)險增加[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率隨著年齡的增長而逐漸增加，人口老齡化現(xiàn)象將導(dǎo)致世界人口骨質(zhì)疏松癥的比例增加[2]。

祖國醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松癥歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，根據(jù)中醫(yī)“腎主骨生髓”理論，總結(jié)得出本病病因病機(jī)主要由于腎精虧虛[3]。大量研究表明，中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松癥中有其獨(dú)特的優(yōu)勢和療效，有效地改善骨密度及臨床癥狀[4]。

國醫(yī)大師劉柏齡教授擅長治療脊柱疾病、關(guān)節(jié)炎等骨科常見病癥[5]。20世紀(jì)50年代初，劉柏齡教授依據(jù)“腎為先天之本”，創(chuàng)立“治腎亦治骨”的學(xué)術(shù)思想，這是近現(xiàn)代最早記載的“腎主骨”相關(guān)文獻(xiàn)[6]?；谶@一學(xué)術(shù)思想，創(chuàng)立補(bǔ)腎健骨治則，研發(fā)院內(nèi)制劑“健骨膠囊”，在長期的臨床實(shí)踐和治療中，具有很好的療效且安全性高。

本研究以MC3T3-E1細(xì)胞為對象，觀察健骨膠囊提取物對成骨細(xì)胞的增殖、遷移和分化的影響，從分子生物學(xué)水平上探討健骨膠囊防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：MC3T3-E1細(xì)胞株(美國ATCC)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物：健骨膠囊組成：熟地黃67.5 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：210101CP102)；淫羊藿67.5 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：200801CP614)；骨碎補(bǔ)45 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：23620010)；肉蓯蓉45 g(安國市譽(yù)林藥業(yè)有限公司，批號：191201)；鹿角霜45 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：201201CP497)；牡蠣67.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：200801CP614)；龜甲45 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201201)；黃芪45 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：28121032)；當(dāng)歸31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201206)；鹿銜草31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：200801)；雞血藤31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201401)；杜仲31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201202)；陳皮22.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201302)；三七22.5 g(酒泉市塔豐中藥村生態(tài)種植加工有限公司，批號：201201)；萊服子22.5 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：24920013)。

1.1.3試劑：NEST細(xì)胞培養(yǎng)板；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 HyClone公司，批號：AG29642090)；胎牛血清(以色列Biological Idustries公司，批號：2053264)；胰蛋白酶(美國MRC公司，批號：T210118)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國Med Chem EW xpress公司，批號：98259)；茜素紅染料(Alizarin red)(北京索萊寶科技有限公司，批號：919G0033)；CCK8試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：BA03175388)；熒光定量PCR試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號：AKE1146A]。

1.1.4儀器：Heto Power Dry LL3000型冷凍干燥機(jī)(美國LABCONCO 公司，型號：CORPORATION KANSAS CITY，MISSOURI 64132)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司，型號：CFX ConnectTM Optics Modulie)；大屏幕數(shù)碼倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Infnite 200 PRO型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司，型號：INFINITE 200 PRO)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1健骨膠囊提取物的制備：本實(shí)驗(yàn)所使用的健骨膠囊方由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院國醫(yī)大師劉柏齡提供，組方共含有15種中藥，包括熟地黃、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、鹿角霜、牡蠣、黃芪、龜甲、當(dāng)歸、鹿銜草、雞血藤、杜仲、陳皮、三七、萊服子。健骨膠囊提取物制備方法如下：(1)上述藥物按固定計量混合后浸泡2 h；(2)浸泡后的藥物置于砂鍋中100 ℃沸水中煎煮30 min后，用紗布過濾收集藥液，重復(fù)上述操作2次；(3)將3次濾得的藥液使用冷藏離心機(jī)離心。收集上清液通過中空纖維膜濾柱過濾進(jìn)一步澄清，并在-80 ℃儲存過夜，隔日使用冷凍干燥機(jī)凍干。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細(xì)胞每3 d傳代1次，培養(yǎng)基組成(DMEM培養(yǎng)基加入胎牛血清10 %及青霉素-鏈霉素溶液1 %)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將消化重懸后的細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3 000個，共設(shè)置7個不同濃度的含健骨膠囊提取物溶液分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，分別向每孔加入10 μL CCK8工作液，培養(yǎng)箱中37 ℃條件下孵育1 h，檢測450 nm波長處的吸收值。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)，以評估細(xì)胞遷移能力。將消化重懸后的細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)密度為1×105/mL，用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為100 %，后用槍頭刮擦，PBS清洗后，細(xì)胞分別用1.6 mg/mL的DMEM及健骨膠囊溶液處理，對細(xì)胞初始劃痕狀態(tài)要拍照留存，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8、16和24 h后，鏡下觀察，并記錄拍照，以觀察細(xì)胞的遷移情況。

1.2.5茜素紅染色及定量：將MC3T3-E1細(xì)胞接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔20 000個細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用基于細(xì)胞增殖測定結(jié)果的最佳濃度的健骨膠囊提取物處理，對照組用普通培養(yǎng)基處理，并在含有5 % CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育7 d，隔天換液。7 d后取出所有培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入95%乙醇在室溫下進(jìn)行細(xì)胞固定15 min。用ddH2O洗滌3次后，將固定細(xì)胞在室溫下置于搖床上，用1 %茜素紅S染色液染色0.5 h，用ddH2O洗搖5 min，洗搖操作重復(fù)4次。染色后用體式顯微鏡及大屏幕數(shù)碼倒置顯微鏡4倍和10倍鏡下拍攝。通過在室溫下用10 %乙酸溶解染色的細(xì)胞0.5 h并輕輕搖動進(jìn)行定量分析，隨后渦旋30 s、加入200 μL液體石蠟，85 ℃水浴10 min，12 000 rcf離心5 min，取下清液用10 %氨水中和pH至4.1，使用酶標(biāo)儀在405 nm的光密度下進(jìn)行定量分析。

1.2.6QRT-PCR檢測成骨相關(guān)mRNA的表達(dá)在藥物干預(yù)的第24小時進(jìn)行Real-time PCR檢測：6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)密度為5×105cells/mL，實(shí)驗(yàn)組和對照組加藥培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后每孔加入Buffer RZ 1 mL，裂解5 min后吹洗，并將轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，按照TIANGEN總RNA提取試劑盒操作方法提取RNA，測濃度定量。將制備好的健骨膠囊組和空白組的MC3T3-E1細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄步驟得到cDNA；使用SYBR熒光染料進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系配置見表1。按預(yù)設(shè)程序，將反應(yīng)液放置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)。階段1(1次循環(huán))：95 ℃ 3 min；階段2(40次循環(huán))：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s。數(shù)據(jù)處理：擴(kuò)增完畢后，得到目的基因及內(nèi)參基因表達(dá)的CT值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析[7]。Gapdh、Runx2，Col1a1、Ocn、Opn、Bcl2、Alp，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系Table 1 qRT-PCR experimental reaction system

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)：6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)密度為5×105cells/mL，實(shí)驗(yàn)組和對照組加藥培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后每孔加入蛋白裂解液，裂解30 min后吹洗。收集蛋白后上樣于10 % SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，隔日更換二抗，室溫孵育2 h，顯色、分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 健骨膠囊提取物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

本研究以空白培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)對照，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的健骨膠囊提取物溶液干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，結(jié)果表明(圖1)，與對照組比健骨膠囊提取物能明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖(**P<0.01)，且在濃度為1.6 mg/mL時，細(xì)胞增殖效果最好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也采取該濃度進(jìn)行。

2.2 對MC3T3-E1遷移的影響

檢測健骨膠囊方含藥血清對MC3T3-E1細(xì)胞遷移能力的影響，進(jìn)行細(xì)胞平板劃痕實(shí)驗(yàn)，并在劃痕后0、8、16、24 h進(jìn)行拍照、分析。如圖3所示，在第8小時加藥組與空白組無明顯差異，在第16小時可以明顯發(fā)現(xiàn)加藥組具有更好的向空白區(qū)域遷移的能力；在第24小時可以發(fā)現(xiàn)加藥組已經(jīng)完全將空白區(qū)覆蓋，然而空白組仍存在部分區(qū)域空白區(qū)。因此可以發(fā)現(xiàn)在健骨膠囊含藥血清的干預(yù)下MC3T3-E1遷移能力明顯增強(qiáng)。見圖2。

2.3 健骨膠囊提取物對MC3T3-E1細(xì)胞成骨礦化的影響

藥物干預(yù)7 d后，茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)健骨膠囊提取物組優(yōu)于空白組，茜素紅染色定量顯示實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞成骨礦化能力明顯優(yōu)于對照組(**P<0.01)，見圖3。

2.4 對MC3T3-E1成骨相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)健骨膠囊膠囊提取物干預(yù)24 h后，與空白組比較，Runx2、Ocn、Col1a1、Alp、Opn的 mRNA表達(dá)顯著升高(**P<0.01)，Bcl2的mRNA表達(dá)升高(*P<0.05)，與成骨細(xì)胞相關(guān)mRNA上調(diào)趨勢相同，且結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

2.5 對MC3T3-E1成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)健骨膠囊提取物干預(yù)24 h后，與空白組比較，Col1、Bcl2的蛋白表達(dá)升高。見圖5。

3 討論

目前西醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥主要通過雌激素以及雙膦酸鹽類藥物為主[8]，雖然治療效果明顯，但也會引起一些肝腎及骨骼方面的不良影響。而中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥，在療效顯著的同時具有不良反應(yīng)小、成本低的特點(diǎn)。

健骨膠囊是國醫(yī)大師劉柏齡教授從醫(yī)60余載總結(jié)歸納出的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎健骨，養(yǎng)血舒筋，通絡(luò)止痛的功效[9-10]。本方君藥熟地黃，甘溫味厚，質(zhì)地柔潤，入腎補(bǔ)腎，滋腎水，益腎陰，為補(bǔ)腎陰之要藥；臣藥為淫羊藿、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、鹿角霜、龜甲、杜仲均有補(bǔ)腎健骨，填精生髓的功效；佐藥牡蠣、黃芪、當(dāng)歸、三七、雞血藤滋陰潛陽，活血生新，以壯腎髓；使藥為陳皮、萊菔子，調(diào)和諸藥，促進(jìn)脾胃運(yùn)化。

基于本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)健骨膠囊能促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖及細(xì)胞遷移能力，并通過上調(diào)成骨細(xì)胞特定基因及蛋白的表達(dá)，提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的成骨能力。這對中藥治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)室研究和臨證診療提供良好的理論基礎(chǔ)，由于中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)多途徑的特性，對于進(jìn)一步探究其治療其他骨科疾病的作用效果及分子機(jī)制做鋪墊，同時為國醫(yī)大師劉柏齡“腎主骨”理論臨床診療的探尋提供一種思路。

由于臨床上中藥復(fù)方制劑常用給藥途徑為口服給藥，因此本研究采用健骨膠囊提取物凍干粉直接干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞的方法存在一定的局限性。由于不同藥物生物利用度差異，凍干粉與藥物服用后的入血成分可能會存在不同，因此在今后的研究中將進(jìn)一步采用動物實(shí)驗(yàn)對健骨膠囊的分子機(jī)制做更加系統(tǒng)和深入的研究。鑒于本課題組在前期研究中，針對中藥復(fù)方及中藥材提取物進(jìn)行了一系列的體內(nèi)外活性及生物學(xué)機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)這些中藥制劑在細(xì)胞水平與動物水平上的藥效活性基本一致，因此，本研究基于細(xì)胞水平的研究將對后續(xù)更加深入的動物水平研究具有一定的指導(dǎo)作用[11-13]。