梓醇防治骨質疏松癥的研究進展

孫娜 徐蕾 隋文靜 李寒 曹益國 孫慧君 李忠海, 5 田康,5 石志華 徐鋼,5*

1. 大連市第三人民醫院，遼寧 大連 116091

2. 大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧 大連 116011

3. 大連市公共衛生臨床中心，遼寧 大連 116001

4. 大連醫科大學，遼寧 大連 116044

5. 遼寧省骨相關疾病修復重塑分子機制重點實驗室，遼寧 大連 116011

骨質疏松癥常易導致骨折，致殘和致死率高，嚴重影響患者生活質量，被世界衛生組織認定為重要的全球性健康防治課題之一[1]。中藥地黃具有滋陰養血、益精填髓等功效，作為中醫臨床常用藥之一，常常組方用于防治骨質疏松癥[2-5]。梓醇(catalpol)是中藥地黃的主要活性成分之一，2020版中國藥典中以梓醇和毛蕊花糖苷作為地黃的鑒別內容，以梓醇和地黃苷D作為含量測定內容[6]。梓醇是一種環烯醚萜類化合物(圖1)，具有抗炎和抗氧化等藥理活性，能夠發揮一定的抗抑郁、改善認知和保護腦細胞作用，降血糖和改善糖尿病并發癥，抗腫瘤和保護心血管系統等[7]?，F將梓醇防治骨質疏松癥方面的研究歸納總結，為深入挖掘其抗骨質疏松作用和發現新靶點提供借鑒。

1 梓醇抗骨質疏松作用的體內實驗研究

在顱骨缺損的6周雄性SD大鼠中，搭載梓醇和經梓醇干預的骨髓間充質干細胞(BMSCs)的水凝膠支架能夠顯著提升其骨愈合能力[8]。此外，在卵巢切除8周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持續8周，能夠減少骨丟失，增加骨小梁數量[8]。在卵巢切除聯合顱骨缺損的12周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持續8周，能夠促進骨再生和血管形成[9]。在高脂飼料聯合鏈脲佐菌素(STZ)誘導8周雌雄各半Wistar大鼠糖尿病骨質疏松模型中，含有梓醇等的熟地黃可以調節血清堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)水平，提高骨密度，改善骨微結構[10]。在高脂飼料聯合STZ誘導7周雄性ICR小鼠糖尿病骨質疏松模型中，每天分別灌胃梓醇30、90 mg/kg，持續12周，能夠減少骨小梁結構的退行性改變，從而顯著改善骨小梁惡化，影響ALP、I型膠原蛋白和OCN等骨形成標志物水平以及OPG/RANKL水平[11]。

在尼古丁誘導5周雄性Wistar大鼠牙槽骨損傷模型中，皮下注射2 μg/kg梓醇，持續14 d，能夠減少骨質流失，影響ALP、OCN和TNF-α等水平[12]。在脂多糖(LPS)誘導C57BL/6小鼠骨質疏松模型中，每天分別經腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持續7 d，均可以減少骨丟失，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色顯示梓醇顯著抑制過度的破骨細胞形成[13]；在卵巢切除8周雌性C57BL/6中，每天分別經腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持續6周，可緩解破骨細胞過度形成，高劑量梓醇顯著降低血清CTX-1水平[13]。在卵巢切除8周雌性BALB/c小鼠和14個月雌性自然衰老BALB/c小鼠中，脾細胞中Th1/Th2比值均明顯增大，與骨密度呈負相關；在前者模型中，灌胃梓醇可以顯著增加骨密度，并且呈劑量依賴性[14]。而且，梓醇并未升高血清雌激素水平，而顯著降低血清CTX-I水平，并且呈劑量依賴性，說明可能與抑制破骨細胞功能有關[14]。此外，灌胃梓醇后小鼠脾細胞中Th1細胞比例下降，而Th2細胞比例上升，而且，梓醇調節Th1/Th2比例也呈劑量依賴性。進一步地，梓醇對調節Th1/Th2亞群比例的關鍵轉錄因子的調節作用也呈劑量依賴性[14]，這可能是梓醇發揮骨保護作用的分子機制之一。

筆者通過上述文獻研究發現，在體內研究方面，大鼠[8-10,12]、小鼠[11,13-14]、雄性[8,10-13]、雌性[8-10,13-14]等動物研究對象和顱骨缺損[8-9]、卵巢切除[8-9,13-14]、高脂飼料聯合STZ[10-11]、尼古丁誘導[12]、LPS誘導[13]等造模方法的實驗結果均顯示梓醇具有抗骨質疏松作用。梓醇對于卵巢切除和糖尿病等常見骨質疏松模型均發揮防治作用，說明其可用于治療高轉換型和低轉換型等不同類型的骨質疏松癥，這可能與其多靶點的作用機制有關，體內作用機制仍待進一步深入研究。

2 梓醇抗骨質疏松作用的體外實驗研究

2.1 梓醇對于BMSCs的影響

在SD大鼠BMSCs中，梓醇25、50、100 μmol/L 作用24 h或者10、25、50、100 μmol/L 作用48 h均顯著促進增殖；此外，梓醇50 μmol/L或100 μmol/L增強了ALP活性，而且茜素紅染色也驗證了促成骨活性[9]，該作用可能與激活JAK2/STAT3軸有關[9]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇促進細胞增殖和成骨分化，最佳濃度分別為1.0 mg/L和2.0 mg/L，梓醇促進向成骨細胞分化和轉化后的成骨細胞成熟，上調Runx2 和OCN表達，增加ALP 的分泌沉積。該作用可能與Wnt信號通路激活有關[15]；類似地，10、50 、250 μmol/L梓醇并不影響增殖，而三個濃度均增加ALP活性且三者間無顯著性差異，50 μmol/L和250 μmol/L的梓醇可以顯著增強茜素紅染色[8]。進一步，梓醇增加成骨分化相關基因和蛋白的表達，且被初步證實與激活Wnt/β-catenin信號通路有關[8]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇0.05 mg/L～10 mg/L均促進增殖，其中濃度1.0 mg/L作用最強；當濃度大于等于20 mg/L時，梓醇對增殖能力無明顯影響。梓醇0.2～100 mg/L均可以增強ALP 活性，其中濃度2.0 mg/L組ALP活性顯著高于其它組。梓醇0.2、1.0、2.0、20 mg/L均可以增加礦化結節數量，促進成骨細胞成熟[16]。在SD大鼠BMSCs中，不同濃度的梓醇促進了增殖；1×10-5mol/L～ 1×10-3mol/L梓醇可以誘導成骨分化，1×10-4mol/L為最佳濃度；梓醇還可以增加ALP活性、礦化結節數目和OCN含量；該作用機制可能與Hedgehog信號通路有關[17]。

2.2 梓醇對于成骨細胞的影響

在MC3T3-E1中，梓醇1×10-9mol/L～1×10-7mol/L促進增殖；梓醇1×10-6mol/L ～1×10-5mol/L增強ALP和OCN活性，促進鈣化[18]；在SD大鼠成骨細胞中，梓醇1×10-3、1×10-5、1×10-7、1×10-9mol/L均促進增殖。ALP活性顯示高濃度梓醇顯著促進成骨分化，具有量效關系。不同濃度梓醇均顯著增強OCN活性[19]。

在MC3T3-E1中，梓醇在很高濃度條件下，細胞活力未被抑制。不同時間點不同濃度的梓醇均未明顯促進增殖。梓醇濃度達到500 mg/L時，明顯升高ALP 活性，且促進鈣結節形成[20]。在以成骨細胞為色譜膜源篩選六味地黃湯中抗骨質疏松活性成分的實驗中，對于親和強度以及含量較高的梓醇進行了體內外藥效驗證，驗證了梓醇(1.0、10 μmol/L)顯著促進小鼠成骨細胞增殖，且提高骨質疏松斑馬魚模型的頭部骨礦化面積[21]。類似地，通過成骨細胞膜色譜/質譜法快速篩選了六味地黃煎劑含藥血清中的成骨活性成分，梓醇等四者(濃度均為0.1 μmol/L)均能顯著促進MC3T3-E1增殖和ALP染色[22]。

2.3 梓醇對于高糖造模成骨細胞的影響

在高糖造模MC3T3-E1中，梓醇能夠通過調節BMP和IGF-1/PI3K/mTOR途徑促進增殖和增強ALP活性，并通過信號通路抑制劑和分子對接研究加以證實[10]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、10 μmol/L的梓醇均能夠增加ALP表達，二者的鈣化基質茜素紅染色斑均更密集、更廣泛，而且顯著增加OPG/RANKL的比值[11]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、2、4 mg/mL的梓醇可以劑量依賴地改善受損增殖狀態，且ALP活性和礦化結節數量增加，成骨分化相關蛋白表達增加。進一步實驗發現，梓醇通過抑制高糖誘導的KDM7A蛋白表達而調節Wnt/β-catenin信號通路[23]。

2.4 梓醇對于其他成骨細胞模型的影響

在LPS造模SD大鼠成骨細胞中，梓醇濃度小于1 mg/L時，未明顯促進增殖；當濃度大于10 mg/L時，則明顯促進增殖并無毒性作用；當濃度小于1 mg/L時，未明顯保護成骨細胞炎性反應；而濃度大于10 mg/L時，則明顯保護細胞炎性反應[24]。在2,3,7,8-四氯二苯對二噁英造模MC3T3-E1中，梓醇抑制細胞活性減弱，抑制增加的細胞凋亡和自噬，降低一氧化氮和硝酸鹽水平，抑制細胞色素P450 1A1和細胞外信號調節激酶水平升高。而且，梓醇能夠修復超氧化物歧化酶和細胞外信號調節激酶1基因表達，顯著增加谷胱甘肽過氧化物酶4和成骨分化標志物(包括ALP和osterix)表達[25]。在SD大鼠成骨細胞-破骨細胞共育體系中，梓醇(0.05 mg/L～2 mg/L)顯著促進成骨細胞增殖，其中，0.05 mg/L作用效果最強，0.05 mg/L還顯著升高ALP水平。而且，盡管該濃度下梓醇對于成骨細胞中ERα的mRNA表達無影響，但是其顯著上調成骨細胞中ERβ的mRNA表達[26]。

2.5 梓醇對于破骨細胞的影響

在小鼠骨髓巨噬細胞和RAW264.7經RANKL誘導分化的破骨細胞中，梓醇(0、100、200、400 μmol/L)呈現濃度依賴性的早期抑制破骨分化，破骨細胞數量和面積均減少，但并未促進細胞凋亡[9]。F-肌動蛋白環和骨吸收陷窩實驗顯示梓醇減小成熟破骨細胞F-肌動蛋白環尺寸和骨片骨吸收陷窩面積。梓醇還抑制破骨相關基因表達，梓醇通過調節NF-κB 和AKT信號途徑抑制NFATc1基因表達。PTEN被認為是RANKL誘導破骨細胞生成的重要調控因子，PTEN在破骨細胞形成過程中調控RANKL刺激的AKT和NF-κB信號通路，梓醇可以通過調節PTEN的泛素化和降解以抑制破骨分化[13]。在上述共育體系中，0.05 mg/L濃度的梓醇作用48、72、96 h 后顯著抑制破骨細胞的骨吸收陷窩數量和TRAP活性[26]；梓醇0.05 mg/L～50 mg/L顯著減少骨吸收陷窩數目，可以抑制破骨細胞活性，0.05 mg/L梓醇誘導破骨細胞凋亡，其機制可能與上調成骨細胞中OPG基因表達有關[27]。

通過上述文獻研究發現，在促進細胞增殖方面，多個體外實驗結果顯示梓醇具有一定的促進BMSCs[11,13]和成骨細胞[8,14-15,17-18,20]增殖作用；在促進細胞成骨分化方面，多個體外實驗結果顯示梓醇具有一定的促進BMSCs[7,11-13]和成骨細胞[8,14-20]成骨分化作用，可能影響Wnt和Hedgehog等信號通路。此外，梓醇還具有一定的抑制破骨活性作用[9,20-21]，可能影響PTEN/RANKL信號通路。

3 討論和總結

結合上述體內外研究結果，筆者認為梓醇具有一定的抗骨質疏松活性，這與其能夠促進BMSCs及成骨細胞增殖和分化、抑制破骨細胞活性有關，很可能從幾個方面同時發揮作用，體現了其多靶點作用的治療特點，可能對于成骨不足的低轉換型和破骨明顯大于成骨的高轉換型骨質疏松均具有防治作用，而且可以促進大鼠骨折愈合[28]。將體內動物實驗和體外細胞模型相結合進行研究對于闡明梓醇的抗骨質疏松作用意義重大。

中藥地黃具有滋陰養血、益精填髓等功效，具有一定的降糖作用[3]，同時具有抗骨質疏松作用[2-4]，其組方在臨床上也多用于糖尿病性骨質疏松癥的治療[5]。而梓醇作為地黃的主要藥效成分，也具有降糖和改善糖尿病并發癥[7]以及抗糖尿病性骨質疏松(糖尿病并發癥之一)的作用[10,23,29]，梓醇是否通過影響糖尿病和骨代謝關鍵分子AMPK[30]而發揮作用？這些問題以及相關作用機制仍待解決和深入研究。

目前，已有越來越多的文獻報道了有關骨質疏松癥治療藥物的新發現[31]，對于梓醇抗骨質疏松作用靶點方面仍待深入挖掘。結合梓醇化合物具有的自身抗氧化性質[7]，正如已有文獻報道[13,25]，建議多從氧化還原反應角度加以深入探究。綜上所述，梓醇抗骨質疏松作用的深入研究將有助于解析中藥地黃防治骨質疏松癥的作用機制以及開發療效更佳的抗骨質疏松治療藥物。