復合米糠蛋白-卵白蛋白的起泡特性及相關機理分析

張燕鵬，張曼君，刁云春，張維農，胡志雄，胥 偉,*

（1.武漢輕工大學 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

米糠蛋白（rice bran protein，RBP）不僅氨基酸配比合理均衡，營養價值較高，而且具有低過敏性、高消化率等良好的生理功能特性，因此是一種優質的植物蛋白質資源，特別適合開發應用于嬰幼兒和特殊人群營養配方食品。另外RBP中高含量的白蛋白和球蛋白使其具有較好的溶解性和其他相關的加工功能特性，如起泡性和乳化性，因此也可被研究作為起泡劑與乳化劑而應用于食品加工中。卵白蛋白（ovalbumin，OVA）作為蛋清中的主要蛋白質，因其分子結構中含有較多的疏水性氨基酸組分，可作為乳化劑和發泡劑以使得多相體系保持良好的穩定特性，因此是食品加工制備過程中一種良好的功能性成分。已有研究表明，RBP在等電點附近的起泡能力較差，而OVA在等電點附近時其起泡能力則較好，這表明不同來源的蛋白質根據環境因子的變化會表現出不同的起泡特性，這也使得單一蛋白質在泡沫型食品加工過程中具有一定的局限性。因此在實際應用中如果可以將兩種或更多的蛋白質復配應用，不僅可以增加蛋白質營養功效，同時也是一種簡單高效的改善蛋白質溶液功能特性的方法。

本課題組前期研究發現當RBP溶液pH 4.0和pH 7.0時，添加1%的NaCl其起泡能力可以顯著性增加，但只對pH 7.0條件下的泡沫穩定性有顯著改善。因此結合上述的相關內容，本實驗主要研究在pH 4.0和pH 7.0條件下添加1% NaCl后，RBP-OVA所組成RBP-OVA復合蛋白溶液起泡特性的變化規律，并對比研究分析溶液狀態和泡沫狀態下相關蛋白質的理化特性，以探討RBP-OVA復合蛋白在起泡特性上的互補協同作用及其相關機理，以期為復合蛋白質在實際應用中提供理論依據，并為促進RBP在食品加工領域的應用發展提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RBP（蛋白質質量分數84.9%）由實驗室自制；OVA（純度62%～88%）、1-苯胺基萘-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，分析純） 美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SorvallRC6Plus型高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；FiveEasy實驗pH計 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；KND-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；手持式30631型電動打蛋器 日本ECHO公司；Zetasizer-NanoZS納米粒度電位儀 英國Malvern Instrument公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立公司；HJ-4多頭磁力加熱攪拌器 金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RBP與OVA的復合蛋白質溶液配制

分別稱取適量的RBP與OVA配制5 mg/mL蛋白質溶液，于磁力攪拌器上攪拌2 h后放入4 ℃冰箱水化過夜。將按照RBP-OVA質量比分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1配制蛋白質量濃度為5 mg/mL的RBP-OVA復合蛋白質溶液，并分別調節至pH 4.0和pH 7.0，另外取部分RBP-OVA復合蛋白質溶液再添加1% NaCl以研究鹽離子對其起泡特性的影響。

1.3.2 蛋白質溶液起泡特性的測定

起泡特性的測定在解長遠和Sheng Long等方法基礎上作一定的修改。取30 mL蛋白質溶液于特制帶刻度的試管（直徑4 cm、高10 cm）中，將電動打蛋器伸入到溶液中約1 cm處，攪拌15 s后，立即測量泡沫體積，靜置2 h后再次測定體積。按式（1）、（2）計算蛋白質的起泡能力及泡沫穩定性：

1.3.3 泡沫狀態下蛋白質樣品的制備

取RBP-OVA復合蛋白質溶液，按1.3.2節方法進行攪打起泡后，收集其上層泡沫待消泡后備用。

1.3.4 蛋白質粒徑分布與Zeta電位測定

根據Wouters等的方法測定蛋白質的粒徑分布與Zeta電位。取一定量的蛋白質溶液，于25 ℃、8 000 r/min離心15 min，調節蛋白質溶液的質量濃度為0.2 mg/mL，采用納米粒度電位儀，測定蛋白質溶液的粒徑分布與Zeta電位。

1.3.5 蛋白質的表面疏水性測定

參考馮芳等的方法，用ANS作熒光探針測定蛋白質的表面疏水性。取配制好的蛋白質溶液在25 ℃、8 000 r/min離心20 min后，分別配制質量濃度0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的蛋白質溶液，并依次在5 mL不同質量濃度的蛋白質溶液中加入20 μL 8.0 mmo1/L的ANS溶液。采用熒光分光光度計測定加入ANS的蛋白質樣品溶液及對照溶液的熒光強度，設定激發光和發射光分別為390 nm和470 nm，設定狹縫寬度為5 nm，將測定數據以蛋白質量濃度和熒光強度分別為橫縱坐標作圖，曲線斜率即為蛋白質的表面疏水性指數。

1.3.6 蛋白質的熒光光譜測定

參考Zhang Yanpeng等的方法測定RBP內源熒光光譜。取配制好的蛋白質溶液在25 ℃、8 000 r/min離心15 min后，將蛋白質溶液質量濃度調節為0.2 mg/mL，使用熒光光譜儀，設定激發波長為295 nm，在300～480 nm范圍內1 200 nm/s進行掃描分析。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次求平均值，采用Origin 8.5和SPSS分析軟件對實驗數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質溶液的起泡特性分析

2.1.1 蛋白質溶液在pH 4.0條件下的起泡特性

圖1 蛋白質溶液在pH 4.0條件下的起泡特性Fig. 1 Foaming properties of proteins at pH 4.0

由圖1a可知，當pH 4時RBP的起泡能力明顯低于OVA，二者分別為20.0%和37.2%，而隨著RBP在RBPOVA復合蛋白中含量的減少，其起泡能力逐漸增加。這可能與兩種蛋白質在pH 4.0條件下所帶的凈電荷量，蛋白溶解度，粒徑分布及分子結構不同有關，而這些理化性質可以影響蛋白質分子在界面的吸附速度，從而使其具有不同的起泡能力。由圖1b可知，當pH 4.0時RBP的泡沫穩定性優于OVA，且當RBP-OVA質量比為3∶1、1∶1和1∶3時，RBP-OVA復合蛋白在2 h以后的泡沫穩定性相對OVA有顯著（＜0.05）的改善，并且在1∶1和1∶3條件下RBP-OVA復合蛋白溶液的泡沫穩定性在2 h后表現為協同作用，泡沫穩定性均高于單一的蛋白質溶液，這可能由于兩種蛋白質在該條件下可以在界面處產生相互作用形成較好的黏彈性界面膜，使得RBP-OVA復合蛋白質溶液的泡沫體系相對穩定。

圖2 蛋白質在pH 4.0、1% NaCl條件下的起泡特性Fig. 2 Foaming properties of proteins under pH 4.0 and 1% NaCl conditions

由圖2a可知，在加入1% NaCl后兩種蛋白質的起泡能力均顯著增加，且RBP-OVA復合蛋白質的起泡能力表現為協同作用，特別是當RBP-OVA質量比為3∶1時，RBPOVA復合蛋白質的起泡能力可達176.9%，與OVA的起泡能力相比沒有顯著性差異（＞0.05）。這說明鹽離子的添加可改變蛋白質的表面凈電荷，粒徑分布或者分子結構，從而使得蛋白質分子易于吸附至氣-水界面。由圖2b可知，隨著OVA在RBP-OVA復合蛋白質中比例的增加，其泡沫穩定性顯著下降，當RBP-OVA質量比為3∶1時，RBP-OVA復合蛋白在1～1.5 h內的泡沫穩定性相對RBP泡沫穩定性無顯著差異（＞0.05），但相比OVA則有顯著（＜0.05）的改善。另外與未加NaCl的RBPOVA復合蛋白溶液相比，RBP-OVA質量比為3∶1時的RBP-OVA復合蛋白在2 h內的泡沫穩定性可顯著性增加至86.7%，這表明在該條件下RBP-OVA復合蛋白質的分子結構與物化性質可保持較好的平衡，既能使其起泡能力得到較好的改善，同時也能使RBP-OVA復合蛋白保持較好的泡沫穩定性，從而為在等電點附近蛋白質得到更廣泛的應用提供了基礎。

2.1.2 蛋白質溶液在pH 7.0下的起泡特性

由圖3a可知，當pH 7.0時，RBP的起泡能力優于OVA，且RBP-OVA復合蛋白質起泡能力隨RBP比例的減少而降低。這表明與pH 4.0相比，兩種蛋白質的物化性質和分子結構在pH 7.0發生了改變，使得其起泡能力發生了變化。圖3b結果表明，在pH 7.0條件下，RBP的泡沫穩定性比OVA的穩定性差，OVA泡沫穩定性在4 h后依然可高達73.8%，因此在RBP中加入OVA后可一定程度上改善其泡沫穩定性，但隨著OVA比例的增加其改善效果并沒有明顯的增加，這說明OVA對RBP-OVA復合蛋白質泡沫穩定性的提高有限。

圖3 蛋白質在pH 7.0條件下的起泡特性Fig. 3 Foaming properties of proteins at pH 7.0

由圖4a可知，RBP的起泡能力優于OVA，起泡能力可達103.0%，但RBP-OVA復合蛋白質起泡能力隨RBP比例的減少先減少后增加。與圖3a相比，在pH 7.0條件下NaCl的添加均可以使得蛋白質的起泡能力增加，但RBPOVA復合蛋白質的起泡能力則表現為拮抗作用，這說明NaCl的添加使得兩種蛋白質之間的相互作用不利于RBPOVA復合蛋白快速的吸附至氣-水界面以降低界面張力。圖4b結果表明，在該條件下，RBP-OVA復合蛋白質泡沫穩定性隨RBP比例的減少先增加后減少，其泡沫穩定性表現為協同作用，當RBP-OVA質量比為1∶1時，起泡后4 h其泡沫穩定性依然可維持在69.4%，這可能與兩種蛋白質在界面處的相互作用有關。

圖4 復合蛋白質在pH 7.0、1% NaCl條件下的起泡特性Fig. 4 Foaming properties of mixed proteins under pH 7.0 and 1%NaCl conditions

綜合上述有關蛋白質起泡特性的相關分析，進一步研究分析在pH 4.0、1% NaCl的條件下，RBP、OVA以及RBP-OVA復合蛋白（RBP-OVA質量比為3∶1）3種蛋白質體系的相關物化性質。因為在該環境條件下，兩種蛋白質在起泡能力上表現為協同作用的同時也有效改善了RBP-OVA復合蛋白的泡沫穩定性。另外pH 4.0接近兩種蛋白質的等電點，通過對該條件下RBP-OVA復合蛋白的相關理化性質進行分析，有利于促進兩種蛋白在等電點時的加工利用。

2.2 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的粒徑分布分析

由圖5可知，對于各種蛋白質樣品而言，氣-液界面處的蛋白質與溶液中蛋白質具有相似的粒徑分布。在pH 4.0、1% NaCl的條件下RBP的粒徑大于OVA，而當在RBP中加入OVA后，RBP-OVA復合蛋白的粒徑則變小且其粒徑與OVA一致。這說明OVA的加入改變了蛋白質分子間的相互聚集狀態，使得RBP-OVA復合蛋白的粒徑變小，從而使其更易于快速擴散至氣-液界面以改善RBPOVA復合蛋白的起泡能力。

圖5 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的粒徑分布Fig. 5 Particle size distribution of proteins in solution and foam

2.3 蛋白在溶液與泡沫狀態下的Zeta電位分析

由表1可知，在溶液狀態下OVA所帶凈電荷量小于RBP，而較少的凈電荷量有利于降低蛋白質在界面吸附時的空間位阻能量，因此有利于卵蛋白更快的吸附于界面，提高其起泡能力。當兩種蛋白復合時，RBP-OVA復合蛋白的凈電荷量增加，這說明在pH 4.0、1% NaCl條件下兩種蛋白質之間可能發生了相互作用，使得RBPOVA復合蛋白所帶表面電荷增加，水化能力增強，有利于增大其溶解性，進而使得RBP-OVA復合蛋白的起泡能力顯著增加（圖2a）。另外表1顯示泡沫狀態下RBP-OVA復合蛋白質與OVA所帶凈電荷相對溶液狀態下均有所增加，這可能是因為這兩類蛋白質在界面處所受鹽離子的電荷屏蔽作用較弱，而蛋白質表面凈電荷的增加可以使得氣泡之間的電荷排斥作用增強，有利于泡沫體系的穩定性。從不同蛋白質在溶液與泡沫狀態下的Zeta電位的變化可知，凈電荷的變化會一定程度上影響RBP-OVA復合蛋白的起泡能力與穩定性，但同時也要考慮其他因素比如蛋白質在界面處的排列與相互作用及表面疏水性等物化性質對其起泡特性的影響。

表1 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的Zeta電位Table 1 Zeta potential of proteins in solution and foam

2.4 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的表面疏水性分析

由圖6可知，在溶液和泡沫狀態下，OVA因其含有較多的疏水基團，蛋白質的表面疏水性較高，并且隨RBP所占比例的減少RBP-OVA復合蛋白質的表面疏水性也顯著增加，而表面疏水性的增高有利于RBP-OVA復合蛋白質更容易附到氣-液界面形成泡沫體系。同時結合粒徑以及Zeta電位的實驗結果可知，OVA的物化性質更有利于RBP-OVA復合蛋白起泡能力的提高，這也與圖2a中蛋白質起泡能力結果一致。圖6結果還表明，泡沫狀態下蛋白質的表面疏水性低于溶液狀態下的蛋白質，這說明對于蛋白質的起泡特性而言，蛋白質的表面疏水性達到一定程度后將不會再對其起泡特性產生影響，因此還需要考慮吸附于界面的蛋白質分子結構的影響。

圖6 蛋白質的表面疏水性分析Fig. 6 Analysis of surface hydrophobicity of proteins

2.5 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的熒光光譜分析

由圖7可知，在pH 4.0、1% NaCl的環境條件下，RBP熒光圖譜中的最大發射波長在356 nm，而OVA與RBP-OVA復合蛋白的最大發射波長則在338 nm左右，這說明RBP的分子結構相對比較展開，分子柔性較高，因此其在界面可以快速發生重排以行成黏彈性界面膜，從而有利于泡沫體系的穩定性。當RBP溶液中加入OVA后，RBP-OVA復合蛋白的最大熒光波長發生藍移，這說明RBP與OVA發生相互作用而使得RBP-OVA復合蛋白質分子發生折疊而變的緊密，使得RBP-OVA復合蛋白質的分子柔性結構相對弱于RBP，因此在泡沫穩定性上低于RBP。同時OVA與RBP-OVA復合蛋白在泡沫狀態下的熒光強度低于液體狀態，這表明界面處蛋白質分子微環境的極性增加，分子結構發生去了去折疊。

圖7 蛋白質在溶液與泡沫狀態下的內源熒光光譜圖Fig. 7 Intrinsic fluorescence spectra of proteins in solution and foam

綜合上述研究可知，RBP與OVA在pH 4.0、1% NaCl的環境條件下之所以可產生協同效應，主要是因為二者在與起泡特性相關的分子特性方面具有一定的互補性，這樣有利于從物化性質的不同方面改善RBP-OVA復合蛋白的起泡能力與泡沫穩定性。

3 結 論

分析了在pH 4.0、7.0，1% NaCl等環境條件下，RBP、OVA及二者復合蛋白的起泡特性。研究結果表明NaCl的添加有利于改善蛋白質的起泡能力，且在pH 4.0、NaCl添加量為1%的條件下，當RBP-OVA質量比為3∶1時，其RBP-OVA復合蛋白的起泡能力和泡沫穩定性達到一個相對平衡的狀態，起泡能力可達176.9%，泡沫在2 h內可穩定在86.7%。這表明在適合的條件下以一定的比例將蛋白質進行復合，可改善蛋白質產品的起泡能力和泡沫穩定性，這對泡沫型食品加工的實際加工應用具有一定的指導意義。

通過對蛋白質在溶液和泡沫狀態下相關物化性質的研究表明，在pH 4.0、1% NaCl的環境條件下，RBP與OVA之間可發生相互作用而影響RBP-OVA復合蛋白的凈電荷量、粒徑、表面疏水性及分子結構等蛋白質分子特性，并且這些分子特性在起泡能力與泡沫穩定性方面可以產生一定的協同效應以改善RBP-OVA復合蛋白的起泡特性。