新生小鼠與成年小鼠心肌環狀RNA差異表達分析

賈笑冬， 于海波， 宋海旭， 桑占發， 梅 竹， 劉 晶， 閆承慧

1.北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016；2.解放軍三二二九五部隊 檢驗病理科，遼寧 遼陽 111000

成年哺乳動物心肌細胞失去再生能力是心臟組織發生損傷無法自我修復的根本原因，也是心肌梗死等疾病導致心臟衰竭甚至死亡的關鍵原因［1］。盡管有研究發現成年心肌存在再生潛能［2］，但在大多情況下，成熟心肌的再生能力十分有限，或處于關閉狀態，難以滿足病理情況下心肌增殖修復的需要［3］。闡明成熟心肌增殖再生功能的調控機制，有效誘導損傷的心臟組織通過內源性心肌細胞增殖進行修復，是心血管疾病研究面臨的一項重要挑戰。有研究證實，新生24 h內的小鼠心肌細胞仍具有良好的增殖能力［4］。然而，出生7 d后，隨著心肌細胞成熟，新生小鼠（乳鼠）心肌細胞的增殖能力就會喪失。從遺傳學角度分析，成年小鼠（成鼠）與乳鼠具有完全相同的基因組信息，因此，影響心肌細胞再生功能的調控開關應該主要在基因轉錄調控或轉錄后調控中［5］。環狀RNA（circular RNA，circRNA）通過與關聯的微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，circRNA在病理生理過程中發揮重要作用［6-9］。目前，關于心肌細胞增殖能力調控相關的circRNA報道較少。基于此，本研究應用乳鼠和成鼠的心臟組織進行了全轉錄組芯片的大數據分析，旨在尋找差異表達的circRNA及其轉錄調控網絡的關鍵分子。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 收集新生24 h內的雄性C57BL／6J乳 鼠和8周齡C57BL／6J雄性 成 鼠 各3只。C57BL／6J小鼠購自集萃藥康實驗動物技術有限公司。動物實驗得到北部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準認可。實驗動物造模于北部戰區總醫院全軍重點實驗室完成。

1.2 心臟組織標本收集 將小鼠麻醉，采用眼科剪打開胸腔，摘取心臟，去除心耳。應用生理鹽水灌注沖洗后吸干水分。將標本放置到含有2 ml Trlzol試劑的15 ml離心管中保存。

1.3 RNA提取 在TRIzol試劑中剪碎心臟組織，4℃、12 000r／min離心2 min。將勻漿混合液轉入新EP管中，加入400μl的三氯甲烷，劇烈混勻，4℃、12 000 r／min離心15 min；分離上層RNA移至新EP管中，1:1加入異丙醇，4℃、12 000 r／min離心15 min。棄上清，加入1 ml預冷的75%乙醇重懸沉淀；4℃、12 000 r／min離心15 min，棄上清，加入適量DEPC水溶解RNA。Nanodrop 2000測RNA濃度，評價RNA的完整性。

1.4 芯片分析 Agilent-085631 RNA芯片及數據分析由博淼生物有限公司（Bio Miao Biotechnology Co.，Ltd.中國北京）進行。將總RNA逆轉錄為雙鏈cDNA，合成為cRNA并用Cyanine-3-CTP標記后，進行微陣列雜交，用安捷倫掃描儀G2505C（Agilent Technologies）掃描陣列。應用功能提取軟件（10.7.1.1版，安捷倫科技公司）分析陣列圖像以獲取原始數據。使用Genespring（14.8版，Agilent Technologies）完成原始數據的基礎分析。通過倍數變化以及t檢驗計算P值。上調和下調基因的閾值設置為倍數變化≥2.0，P≤0.05。使用GO分析和KEGG分析確定差異circRNA的生物學功能。基于該物種所有已知miRNA（數 據 來 源 于miRBase V22），應 用miranda程 序［10］預測circRNA序列上可能結合的miRNA，選擇結合能量＜-20 J的已知功能miRNA進行相關分析。

2 結果

2.1 實驗數據變異情況及相關性 根據芯片的探針重復分別計算質控點和非質控點的CV值，取對應的中位值及表示芯片的變異系數，判斷不同樣本的檢測結果檢測體系是否穩定，一般CV值要求低于15%。本次檢測結果中平均CV值為8.16%，最大CV值為9.61%，提示基因芯片檢測成功。進一步應用Pearson Correlation檢驗分析樣本間相關性和主成分，兩組樣本的分布良好，組內CV小。見圖1。

圖1 兩組樣本的主成分分布圖

2.2 circRNA差異表達情況分析 根據分組情況對數據進行過濾并根據對應的閾值（差異倍數＞2，P＜0.05）分別進行差異circRNA篩選，結果顯示，乳鼠circRNA表達上調38個，circRNA表達下調1個。對差異基因進行非監督層次聚類，區分兩組或多組樣本（圖2a）。應用火山圖和散點圖展示差異表達circRNA的差異倍數及P值分布情況（圖2b、圖2c）。

圖2 差異表達circRNA的分布情況（a.乳鼠和成鼠circRNA差異表達的聚類分析圖；b.乳鼠和成鼠circRNA差異表達的散點圖；c.乳鼠和成鼠circRNA差異表達的火山圖）

2.3 差異表達circRNA的宿主基因富集分析 本研究僅對差異表達上調的circRNA宿主基因進行GO富集分析和KEGG分析。GO富集分析顯示，上調表達的circRNA主要與蛋白激酶和RNA相關蛋白的反向激活調控有關，而這些宿主基因最主要的信號轉導調控通路與有絲分裂調控、流體力學調控和硫基代謝調控有關（P均＜0.001）。見圖3。

圖3 GO富集分析及KEGG信號轉導調控分析（a.GO富集分析；b.KEGG分析）

2.4 差異表達circRNA的互作調控miRNA分析 根據芯片分析結果，獲取差異表達倍數＞5的circRNA共有5個，分別是上調表達的mmu-circ RNA-0001016、mmu-circRNA-0000126、mmu-circRNA-0000663、mmu-circRNA-0000914和下調表達的mmu-circRNA-0001718。見表1。

表1 差異表達circRNA及互作miRNA分析

3 討論

細胞死亡期作為急性心肌梗死的關鍵病理分期，貫穿于整個急性心肌梗死損傷修復過程［11-12］。circRNA作為一類新型的非編碼RNA，在心肌細胞增殖調控中可能發揮基礎性作用，有望成為急性心肌梗死后促進心肌細胞增殖的潛在靶點。與傳統的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，由外顯子序列構成，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。功能研究發現，大部分circRNA分子上富含miRNA結合位點，在細胞中起到miRNA海綿的作用，通過解除miRNA對靶基因的抑制作用改變靶基因的表達水平，這一作用機制也被稱為競爭性內源RNA［13］。本研究發現，circRNA-0001016、circRNA-0000126和circRNA-0000663對目前已知的可能參與細胞周期調控的miRNA家族成員miRNA-15、miRNA-34a和let7有相互作用，提示這些circRNA可能通過競爭性內源RNA方式發揮了對心肌細胞增殖的轉錄調控功能。其中，mmu-circRNA-0000914涉及的與增殖有關的miRNA最多，包括既往研究報道的與心肌細胞增殖能力調控密切相關的miRNA-195和miRNA-294［14-15］。此 外，mmu-circRNA-0001718表達下調，且與心肌細胞增殖的負性調控分子miRNA-128有著明顯的相互作用，這些差異表達顯著的circRNA可能通過調控miRNA抑制細胞增殖，進而導致各種心律失常、心肌重構和心衰等永久性心肌損傷的發生。

綜上所述，與成鼠心肌組織比較，乳鼠存在顯著差異表達的circRNA，這些差異表達顯著的circRNA可能通過調控miRNA抑制細胞增殖。闡明并進行關鍵circRNA的調控研究，有可能為心肌細胞增殖的干預研究提供實驗證據。