維生素D對Graves病Th17/Treg細胞失衡的調節作用

史良鳳，蘇怡倩，王傳杰

1.復旦大學附屬金山醫院內分泌科，上海 201508

2.復旦大學附屬金山醫院康復醫學科，上海 201508

維生素D是一種甾體類化合物，在人體正常生理過程中起重要作用，可以調節鈣和磷酸鹽代謝，維持骨骼健康［1］。維生素D又被稱為免疫調節激素，在不同的非骨骼途徑中發揮特殊作用，而血清25-羥維生素D水平低與多種免疫相關疾病的發生相關［2-3］。

Graves病（Graves’ disease，GD）是一種自身免疫性疾病，發病機制較復雜，細胞免疫和體液免疫均參與其中［4］。既往研究［5］證實，CD4＋Th2細胞能誘導促甲狀腺激素（TSH）受體結合抗體的產生，是導致GD發生發展的一個重要免疫因素。而Th17和Treg細胞是近年發現的CD4＋Th細胞新亞型，Th17/Treg細胞比例失衡可導致免疫紊亂及免疫疾病的發生［6］。有研究［7］發現維生素D可抑制Th17細胞增殖，而甲狀腺細胞核內存在維生素D受體，且GD患者存在較嚴重的維生素D缺乏［8］。因此，本研究探討初發GD患者進行外周血1,25-二羥維生素D干預后，Th17、Treg細胞占比及兩者比值的變化，為臨床GD的進一步診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年1月至2020年12月復旦大學附屬金山醫院收治的新發GD患者30例，選擇同期于我院進行健康體檢且年齡、性別相匹配的健康者30例為對照組。納入標準：（1）有甲狀腺毒癥臨床表現；（2）血清游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺激素（FT4）升高，TSH下降；（3）甲狀腺彌漫性腫大；（4）促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）陽性。排除標準：（1）年齡小于18歲或大于70歲；（2）伴有系統性結締組織或其他自身免疫性疾病（如1型糖尿病、白癜風、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、干燥綜合征、強直性脊柱炎等）；（3）有肺部疾病、肝腎功能不全、冠心病等慢性疾病；（4）就診前3個月內應用抗甲狀腺藥物、含維生素D的藥物或保健品以及其他特殊藥物（如胺碘酮、免疫抑制或調節藥物）。本研究通過復旦大學附屬金山醫院倫理委員會批準（JIEC2021-S33），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 臨床觀察指標采集所有的研究對象清晨空腹外周血，應用電化學發光免疫法測定FT4、FT3、TSH、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、TRAb和25-羥維生素D。

1.3外周血單核細胞（PBMC）維生素D干預留取GD患者和對照組EDTA抗凝管的空腹外周血，制備PBMC。將每例GD患者PBMC分為2份：一份不予以維生素D干預（GD未干預組）；另一份PBMC中加入1,25-二羥維生素D3（羅氏公司；10～(-7) mol/L［9-10］，100 μL）干預 48 h（GD干預組）。對GD未干預組、干預后的GD干預組及對照組PBMC進行CD4＋IL-17（Th17細胞）和CD4＋Foxp3（Treg細胞）染色，采用Beckman Gallios流式細胞儀進行檢測，采用Kaluza Analysis 2.1軟件分析檢測結果。

1.4 統計學處理采用SPSS 20.0軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey方法；非正態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以n(%)表示，采用Fisher確切概率法。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 一般資料分析結果（表1）顯示：GD組和對照組年齡、性別差異無統計學意義。GD組血清TSH明顯低于對照組（P＜0.001），FT3、FT4、TPOAb、TRAb高于對照組（P＜0.001），TgAb與對照組差異無統計學意義。2組均存在維生素D不足（25-羥維生素D＜30 ng/mL），其中GD組更低，與對照組差異有統計學意義（P＝0.004）。

表1 GD組和對照組一般資料比較

2.2 外周血Th17細胞占比結果（表2、圖1）顯示：GD未干預組、GD干預組、對照組研究對象間外周血Th17細胞占比差異有統計學意義（F＝32.708，P＜0.001）。GD未干預組與干預組外周血Th17細胞占比均高于對照組（P＜0.001）；GD干預組與未干預組外周血Th17細胞占比差異無統計學意義（P＝0.515）。

圖1 流式細胞儀檢測外周血CD4＋IL-17（Th17細胞）占比

2.3 外周血Treg細胞占比結果（表2、圖2）顯示：GD未干預組、GD干預組、對照組外周血Treg細胞占比差異有統計學意義（F＝4.050，P＝0.021）。GD干預組外周血Treg細胞占比較GD未干預組高（P＝0.019），兩GD組與對照組外周血Treg細胞占比差異無統計學意義（GD未干預組：P＝0.125；GD干預組：P＝0.711）。

圖2 流式細胞儀檢測外周血CD4＋Foxp3（Treg細胞）占比

2.4 Th17/Treg細胞比值結果（表2）顯示：GD未干預組、GD干預組、對照組外周血Th17/Treg細胞比值差異有統計學意義（F＝36.893，P＜0.001）。兩GD組外周血Th17/Treg細胞失衡比值均高于對照組（P＜0.001）；GD干預組外周血Th17/Treg細胞比值較GD未干預組降低（P＜0.001）。

表2 3組研究對象外周血Th17、Treg細胞水平以及Th17/Treg比值比較n＝30

3 討 論

維生素D是一種類固醇激素，在維持血清鈣、磷水平方面起重要作用［11］。維生素D缺乏目前已成為一個全球性公共健康衛生問題，在健康人群中發生率很高［12］。本研究中健康人群也存在血清維生素D不足，而GD患者維生素D缺乏較健康者更明顯（P＝0.004），與既往相關研究［13-15］結論一致。

維生素D參與細胞生長、分化和機體免疫功能的調節。研究［16］表明，甲狀腺濾泡細胞中存在維生素D受體，1,25-二羥維生素D與其結合后通過基因表達調控影響相應蛋白質的合成。1,25-二羥維生素D在免疫系統中主要作用于抗原提呈細胞（APC）和T細胞，可直接作用于T細胞，抑制抗原特異性T細胞的增殖和細胞因子的產生［17］。目前多項研究［18-19］認為，Th17/Treg細胞失衡是GD發生、發展的重要作用機制之一。已有研究［20］發現，血清維生素D能使Th2細胞活性增強，并使Th1細胞活性減弱。近期有關非甲狀腺自身免疫疾病的研究［7］發現，維生素D能通過抑制Th1/Th17細胞而增強Treg細胞的活性。而補充維生素D可以改善自身免疫性甲狀腺疾病患者的甲狀腺功能及相關抗體水平［21］。此外，國內最新研究［22］發現，在潰瘍性結腸炎患者中，維生素D受體表達與Th17/Treg細胞失衡密切相關。

本研究通過流式細胞學分析發現，GD未干預組外周血Th17細胞占比較健康人明顯升高（P＜0.001），雖然2組外周血Treg細胞占比差異無統計學意義，但Th17/Treg細胞比值差異明顯（P＜0.001）。而加入1,25-二羥維生素D后，外周血Treg細胞占比上調以及外周血Th17/Treg細胞比值明顯下調（P＜0.05），與上述研究結論相符。

GD患者由于甲狀腺激素水平升高，骨吸收加速、破骨細胞活性增強，常存在鈣、磷負平衡，但多數患者發病早期血鈣、磷水平正常［23］。本研究對象為新發GD患者，病程相對短，患者未接受血清鈣、磷水平常規檢測，因此，本研究未納入血清鈣、磷水平，這是本研究的局限性之一。本研究對照組PBMC未給予1,25-二羥維生素D干預，后續須進行優化，以進一步探討維生素D對Th17/Treg細胞的調節作用及免疫調節機制。此外，由于試驗條件限制，本研究未分析臨床治療上補充維生素D后，患者體內Th17/Treg細胞的變化。

綜上所述，本研究發現初發GD患者血清維生素D水平較健康人下降更明顯，外周血Th17細胞明顯增多，存在Th17/Treg細胞平衡破壞，而給予維生素D可改善初發GD患者外周血Treg細胞占比及調節Th17/Treg細胞失衡。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。