前蛋白轉化酶枯草溶菌素9作為評價食管病變內鏡下黏膜下剝離術后患者感染狀況的新標志物

鄒燕婷，寧柳心，馬麗黎，蔡 瑜，張順財，徐蓓莉*

1.復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032

2.復旦大學附屬中山醫院內鏡中心，上海 200032

內鏡下黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）是一種微創手術，住院時間短，廣泛應用于胃腸道淺表腫瘤性病變。然而，由于手術過程中缺損的黏膜暴露于胃腸道菌群中，可能會出現菌血癥和（或）內毒素血癥。發熱可能是手術感染的第1個臨床癥狀。美國胃腸內鏡協會（ASGE）建議ESD手術期間不需常規使用抗生素預防感染，因為菌血癥發生較少且一般持續時間較短［1］。盡管菌血癥的發生率較低，但這種情況可能會引發感染性心內膜炎等嚴重感染，導致嚴重后果。因此，依靠血清標志物及早發現細菌感染并評估其嚴重程度是極其重要的。

在目前的研究［2-4］中，前蛋白轉化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）被證明是感染期間先天性免疫應答的關鍵調節因子，PCSK9在感染性休克中被證實快速上調。在腸源性內毒素血癥肝硬化大鼠中，肝臟PCSK9表達明顯增加［5］。在盲腸結扎穿刺誘導的膿毒癥小鼠中，PCSK9過表達也會加劇IL-6的產生［3］。因食管具有壁薄、易出血、靠近重要器官和動脈的特征，食管ESD比胃和結直腸病變更困難，風險更大，術后感染狀態的監測非常重要。本研究旨在評估PCSK9對食管ESD后早期感染和感染嚴重程度的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年3月1日至2017年10月30日在復旦大學附屬中山醫院被診斷為食管淺表病變并接受ESD治療的65例患者。排除標準：（1）在過去7 d內以任何理由使用抗生素；（2）在ESD手術期間出現任何其他感染跡象；（3）患有慢性非傳染性炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、炎癥性腸病；（4）在ESD前1 d體溫高于37℃；（5）出現內鏡下治療引起的并發癥，如穿孔或大出血等；（6）患有高脂血癥。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準（Y2016-156）。

ESD的手術指征：食管的高級別上皮內瘤變或超聲內鏡證實侵入深度僅限于食管黏膜層的腫瘤，且由CT證實無淋巴結或遠處轉移。

1.2 ESD手術過程在病灶外緣5 mm處進行電凝標記（APC300, ERBE），向黏膜下組織注射少量生理鹽水、腎上腺素、靛胭脂（10∶1∶5）配制的液體，以抬起病變。使用鉤刀（KD-620LR，奧林巴斯）或絕緣頭刀（KD-611L，IT2，奧林巴斯）進行黏膜切開及黏膜下剝離，同時使用凝固器（FD-410LR，奧林巴斯）止血。

1.3 圍手術期管理住院期間監測感染性和出血性并發癥。在圍手術期，如果沒有觀察到感染的臨床跡象，則不使用預防性抗生素。ESD后評估手術時間、傷口大小和體溫。計算從電凝標記到創面凝固完成的時間。將切除的標本放置于軟木板上平整拉開，用大頭針固定，取標本最大的長度和寬度計算傷口區域。如果同時切除≥2個病灶，則將其總數作為一個區域處理。

所有患者ESD后每日監測體溫，達到37.5℃及以上為發熱標準，體溫≥38℃時進行血培養。術前及術后第1天上午檢測外周血白細胞計數（white blood cell，WBC）、中性粒細胞計數、C-反應蛋白（CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子及血清脂多糖、PCSK9水平，評估炎癥反應，并同時檢測肝腎功能等。如果患者術后第2天沒有胸痛、呼吸困難等癥狀，則開始流質飲食。

1.4 血培養當體溫達到38℃時，抽取2套靜脈血行需氧菌、厭氧菌及真菌培養以評估感染情況。血液樣本在35℃下培養3 d，如果有細菌生長，則行微生物鑒定及抗生素敏感試驗。

1.5 ELISA檢測血清LPS和PCSK9采集血液樣本置于含有促凝劑的采血管中，30 min內1 000 r/min離心15 min，收取上層血清保存于－80℃。根據說明書，使用ELISA分別測定血清LPS（武漢華美）和PCSK9（R&D systems DPC900）水平。

1.6 統計學處理采用SPSS 23.0或GraphPad Prism 6.0進行統計分析。數據以x±s或M（P25,P75）進行匯總。組間差異根據數據分布情況通過Student’st檢驗、配對樣本t檢驗、單因素方差分析、秩和檢驗確定。采用Pearson相關系數評估血清PCSK9與LPS水平的關系。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 一般資料分析結果（表1）顯示：共納入患者65例，中位年齡為57歲，53.85%為男性。圍手術期患者肝腎功能無明顯改變。所有靶病灶均進行完整切除，側切緣和基底緣均未發現腫瘤浸潤。病理診斷為高級別上皮內瘤變、鱗狀細胞癌或腺癌，局限于SM1（＜200 μm）。中位手術時間為47.0（36.0，59.5）min，平均切除病灶面積為（9.23±4.65） cm2。

表1 所有患者的一般資料分析

ESD后第1天出現發熱者37例，體溫達38℃者12例，其中1例最高體溫達39℃，血培養脆弱擬桿菌陽性，對常用抗生素敏感，且該患者術后PCSK9水平最高。WBC最高24.15×109/L、中性粒細胞計數最高21×109/L、血清PCSK9最高水平461.67 ng/mL、IL-6最高水平為86.3 pg/mL。體溫37.5～37.9℃的患者根據癥狀、化驗結果等確定是否給予抗生素治療，12例體溫達到38℃的患者均給予抗生素治療，所有發熱患者體溫均在2 d內恢復正常。

2.2 ESD前后炎癥相關指標的比較結果（表2）顯示：術后WBC、中性粒細胞計數、CRP、IL-6均較ESD前明顯升高。而ESR、TNF-α無明顯差異。

表2 ESD前后炎癥相關指標的比較

2.3 ESD后血清LPS和PCSK9水平升高進一步檢測ESD前后第1天的血清LPS和PCSK9水平（圖1）發現，術后患者血清LPS水平明顯升高［（233.69±43.79）pg/mLvs（269.29±52.11）pg/mL，P＜0.001］。同時PCSK9水平也明顯升高［（230.97±37.14） ng/mLvs（301.24±60.92）ng/mL，P＜0.001］。

圖1 ESD前后患者血清LPS和PCSK9水平的變化

2.4 與體溫相關的炎癥標志物的分層分析為明確炎癥標志物與體溫升高的相關性，將患者按術后體溫高低分組后進行比較，結果（表3）發現：與體溫＜37.5℃組相比，體溫≥37.5℃組術后的WBC、中性粒細胞計數、CRP、IL-6、LPS、PCSK9水平明顯更高。

表3 不同體溫組炎癥標記水平的比較

結果（表4、圖2）顯示：12例體溫≥38℃的患者均進行血培養，最終只有1例陽性（PCSK9 461.67 ng/mL、IL-6 6.0 pg/mL、LPS 340.00 pg/mL）。為明確感染情況，將發熱隊列分為37.5℃≤體溫＜38℃ 組 和 體 溫≥38℃ 組。 體 溫≥38℃ 組WBC、中性粒細胞計數均高于37.5℃≤體溫＜38℃組，但差異無統計學意義，而血清PCSK9和IL-6升 高（P＜0.05）。 體 溫≥38℃ 組PCSK9、IL-6的均值和中位數分別為（355.29±56.17）ng/mL、31.8（13.3, 45.6）pg/mL，37.5℃≤體溫＜38℃組為（304.19±60.91） ng/mL、10.2（5.0, 16.4）pg/mL（P＝0.020，P＝0.017）。

圖2 37.5℃≤體溫＜38℃組與體溫≥38℃組患者術后血清PCSK9和IL-6水平

表4 發熱組炎癥標記物的分層分析

2.5 體溫≥38℃患者血清PCSK9與LPS正相關結果（圖3）顯示：對于體溫≥38℃患者，ESD術后血清PCSK9與LPS水平的相關系數為0.720（P＝0.011）。

圖3 體溫≥38℃患者ESD術后血清PCSK9與LPS水平的相關性

3 討 論

本研究率先探討血清PCSK9水平在檢測ESD后早期感染的價值。根據ASGE指南［6］，在食管擴張、靜脈曲張硬化治療、內鏡下逆行胰膽管造影術和超聲內鏡引導下細針穿刺活檢中，提倡適當預防性使用抗生素，其他內鏡下黏膜切除術或ESD不需要常規的圍手術期抗生素預防。術后菌血癥的發生率很低，食管近1%［7］、胃2%～4%［8-9］、結直腸0～2.5%［10-11］，而術后內毒素血癥可能與炎癥反應有關［9］。ESD手術后出現不同程度的發熱，臨床醫生很難確定是否由感染引起。由于血培養所需時間較長且陽性率較低，炎癥標志物如CRP、ESR和降鈣素原被廣泛應用。然而，其局限性在一定程度上仍然存在。CRP在許多非感染性疾病中也有升高［12］；而ESR半衰期長，在評估慢性炎癥方便作用較大［13］；降鈣素原廣泛用于評估全身性感染，特別是敗血癥，但其在局部感染的評估方面可能作用較為有限［14］。因此，需要一種新的生物標志物來幫助識別是否存在ESD術后感染及其嚴重程度。

PCSK9是一種絲氨酸蛋白酶，可通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）抑制循環中內源性脂質清除以調節高膽固醇血癥［15］。LDLR可結合病原菌脂質，如革蘭陰性細菌的脂多糖［16］和真菌的磷脂甘露聚糖［17］，將其從血液中清除。PCSK9在分泌進入循環之前主要在肝細胞中產生［18］，在小腸、腎臟和大腦中也有少量產生［19］。PCSK9在冠心病等動脈粥樣硬化疾病的發病中發揮重要作用［20］，此外，PCSK9在感染中也發揮一定作用。感染特別是內毒素引起的感染，可上調PCSK9的產生。PCSK9過表達可導致肝細胞LDLR降低，從而降低肝臟對病原體脂質（包括LPS）的清除率［21］。肝臟解毒功能的喪失加速了全身細菌傳播，導致多器官衰竭和組織炎癥，因此，PCSK9可能成為一種新的識別體內感染狀態的生物標志物。

本研究發現ESD前后WBC、中性粒細胞計數、CRP、IL-6、LPS和PCSK9水平存在顯著差異，均在術后明顯升高。這可能與ESD引起多種不同程度的炎癥反應相關。同時，術后ESR和TNF-α并沒有明顯的升高，這可能是由于這些標志物不能反映較早期的炎癥水平。

為了確定PCSK9與ESD術后感染的關系，本研究按體溫區間分層分析了血清PCSK9和LPS濃度發現，65例患者中發熱37例，體溫≥38℃者12例。與體溫＜37.5℃組相比，發熱組血清LPS、PCSK9和IL-6水平顯著升高。因此內毒素血癥可能是發熱的主要原因。而在體溫≥38℃和37.5℃≤體溫＜38℃ 2組中，LPS濃度無顯著差異，這可能與本研究樣本量不夠充足有關。與LPS不同的是，血清PCSK9的水平與體溫的升高保持同步。

本研究中血培養陽性患者PCSK9水平最高，提示PCSK9的快速變化可能是菌血癥的可靠指標。IL-6是一種主要由巨噬細胞在識別病原體相關分子模式后迅速產生的細胞因子，表現出的變化趨勢與血清PCSK9相同。在盲腸結扎穿孔術誘導的膿毒癥小鼠中，血清IL-6在膿毒癥早期增加，并隨著穿孔修復而下降，并與PCSK9的過表達相關［22］。雖然本研究中沒有發現PCSK9和IL-6之間的顯著相關性，但PCSK9在早期感染中升高似乎仍然具有一定的意義。

此外，鑒于體溫≥38℃組中LPS和PCSK9的平均濃度較高，進一步檢測這2個指標是否存在相關性，發現其相關系數為0.720（P＝0.011）。因此，體溫≥38℃時，PCSK9與LPS水平密切相關，這可能與細菌感染的刺激和PCSK9的增加抑制其降解有關。由于本研究樣本中體溫≥38℃的患者數量有限，后續需要擴樣本量進行進一步研究，以驗證目前的研究結果，從而明確不同感染的嚴重程度的PCSK9水平的閾值。

綜上所述，本研究擴展了PCSK9對ESD后早期感染的預測作用。循環PCSK9水平在嚴重感染（如敗血癥）時顯著升高。食管ESD相關內毒素血癥可能與炎癥反應密切相關；PCSK9有潛力成為檢測ESD圍手術期感染狀態的敏感和早期診斷標志物。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。