精子正常形態率對補救ICSI結局影響及補救ICSI臨床價值分析*

陳其桂 李大文** 成俊萍 何泳志 龐太森 黃泰帥

1.廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心（南寧 530021）；2.廣西壯族自治區婦幼保健院生殖中心（南寧 530003）

目前，在體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer,IVF-ET）助孕中，有70-80%受精率，但在精液參數分析正常的患者中，仍有一定概率遇到完全受精失敗（total fertilization failure,TFF）或部分受精失敗（partial fertilization failure,PFF）的狀況[1]，這既對病人精神及經濟造成損傷，也令醫生沮喪與困擾。多種因素均可導致受精失敗，如體內激素水平、卵母細胞質量、精子質量異常、減數分裂異常和精卵結合異常等[2，3]。在這些因素中，主要緣由可能是精卵結合異常。

一些研究[4-6]表明，精子正常形態率（Normal sperm morphology rate，NSMR）是導致男性生育力下降、常規IVF失敗的重要原因。鑒于近年來生殖學者們報道的有關精子形態對于體外受精結局的重要預測價值，畸形精子癥（簡稱畸精癥）的定義一直被世衛組織所修正，1992年參考數值為＜30%，1999年為＜14%，2010年下調至＜4%[7]。此研究中，我們將NSMR＜4%定義為畸精癥。為了能夠挽救IVF周期，學者們提出了補救ICSI（rescue intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI），此方法由Nagy ZP等在1993年提出并報道,目前已被廣泛應用并取得成功[8]。然而，關于NSMR是否會影響R-ICSI治療結局目前尚不清楚。為此，本研究旨在探討精子正常形態率對R-ICSI助孕結局的影響，評估NSMR在預測R-ICSI臨床結局中的作用。同時，回顧性分析IVF完全受精失敗或部分受精失敗下R-ICSI的治療情況，以探討臨床可行性及價值。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月-2019年12月在廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心接受R-ICSI的137對不孕夫婦，女方基礎性激素水平及B超檢查示卵巢功能正常。

R-ICSI適應癥及治療：以第二極體作為早期受精的判斷標準，若授精6小時觀察所有成熟卵子中出現明確第二極體的比例＜30%，建議行R-ICSI。對未排出第二極體的卵母細胞，在授精后6-8小時行R-ICSI治療。

入選標準：（1）女方年齡小于38歲；（2）精子來源均為丈夫且通過手淫獲取；（3）所有患者染色體核型檢查正常；（4）超排卵用藥方案為長方案；（5）新鮮移植周期的胚胎均來自R-ICSI。

排除標準：（1）男方服用影響精子質量的藥物；（2）女方子宮腺肌癥、子宮內膜異位癥、多囊卵巢綜合征；（3）夫婦雙方生殖器發育異常、生殖系統感染等。

根據常規IVF受精情況及不同精子正常形態率進行分組：

常規IVF完全受精失敗行R-ICSI：NSMR＜4%組（n=41）和NSMR≥4%組（n=34）；

常規IVF部分受精失敗行R-ICSI：NSMR＜4%組（n=37）及NSMR≥4%組（n=25）。

二、研究方法

（一）促排卵方案

采用促性腺激素釋放激素激動劑（達菲林，益普生公司）/促卵泡生成素（果納芬，瑞士雪蘭諾）和（或）人絕經期促性腺激素（HMG，珠海麗珠制藥）/人絨毛膜促性腺激素（HCG，瑞士雪蘭諾）長方案促排卵。自用促性腺激素4d后開始B超監測卵泡發育，當有2個卵泡直徑＞18mm時，于當晚21:00左右予HCG 10000IU肌肉注射，給藥36h于手術室在陰道B超引導下行經陰道超聲穿刺取卵。

（二）精液采集

男性患者禁欲2～7天，采用手淫法取精液置于干燥消毒量杯內，標本維持20～37℃轉送至實驗室，置于37℃恒溫箱內液化。

（三）精子正常形態率

采用WHO推薦的Diff-Quik快速染色方法精液涂片進行染色。精子形態評估：評估精子形態時采用嚴格標準，只有精子頭、頸、中段和尾部均正常的精子才認為是正常精子。染色后，至少計數200個精子，確定正常精子的形態率。《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版關于精子形態標準：（1）精子頭部外形上應光滑、規則，大體上呈橢圓形；頂體界限清晰，占頭部的40%-70%，（2）中段應細、規則，大約與頭部長度相等，并且主軸與頭部長軸一致，（3）主段應是直的，均一的，比中段細，長約45um。《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標準：精子正常形態率正常參考值≥4%。

（四）受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情況

R-ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。受精后培養3天觀察胚胎狀況，根據胚胎的卵裂球數目、胚胎碎片及卵裂球大小的均一度三方面綜合評估[9]，選擇優質胚胎進行移植，移植胚胎數≤3個，剩余Ⅲ級以上胚胎冷凍保存，并同時予黃體支持。

（五）妊娠判定及隨訪

移植術后14天檢測血β-HCG水平，陽性則確立生化妊娠，于4～6周行B超檢查，若B超見宮腔內孕囊及心管搏動則確立臨床妊娠。我科相關人員電話隨訪并記錄最終結局。

三、計算指標

（一）受精率=受精卵子數/MII卵子數

（二）正常受精率=2PN卵子數/MII卵子數

（三）卵裂率=卵裂數/受精卵子數

（四）優胚率=優質胚胎數/2PN卵裂數

（五）種植率=孕囊數/移植胚胎數

（六）臨床妊娠率=臨床妊娠例數/移植周期例數

（七）活產率=活嬰分娩數/移植周期例數

（八）流產率=臨床流產例數/臨床妊娠例數

四、統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料滿足正態分布，以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；如不符合正態分布則以中位數（最小值，最大值）[M（min，max）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料采用[n（%）]進行表示，使用卡方檢驗進行差異比較。P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（TFF）

兩組患者不育年限、男方年齡、女方年齡、基礎FSH值、基礎LH值、竇卵泡數、HCG日子宮內膜厚度、獲卵數均無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（TFF）

二、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結局比較（TFF）

兩組患者行R-ICSI時受精率、正常受精率、卵裂率、優胚率、種植率、臨床妊娠率、活產率及流產率均無顯著差異（P＞0.05），見表2。

三、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（PFF）

兩組患者不育年限、男方年齡、女方年齡、基礎FSH值、基礎LH值、竇卵泡數、HCG日子宮內膜厚度、獲卵數均無顯著差異（P＞0.05），見表3。

表3 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（PFF）

四、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結局比較（PFF）

兩組患者受精率的比較差異有統計學意義（P＜0.05）。但是，兩組患者正常受精率、卵裂率、優胚率、種植率、臨床妊娠率、活產率及流產率均無顯著差異（P＞0.05），見表4。

表4 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結局比較（PFF）

五、R-ICSI周期（TFF或PFF）胚胎發育及妊娠結局

（一）常規IVF完全受精失敗的R-ICSI周期（新鮮移植周期的胚胎來源均為R-ICSI）：共75個新鮮周期，53個新鮮移植周期，22個取消周期，共722個未受精卵，545個MII期卵子行補救ICSI，卵子再利用率為75.48%（545/722），70.67%（53/75）周期獲得移植。受精卵子數為449個，2PN受精卵子數為406個，卵裂數為440個，2PN卵裂數為397個，優質胚胎數為162個。受精率為82.39%（449/545），正常受精率為74.50%（406/545），卵裂率為98.00%（440/449），優胚率為40.81%（162/397）。總共移植100枚胚胎，孕囊數32個，種植率為32.00%（32/100）。臨床妊娠24例，共22位患者分娩，29個活產兒（單胎15個，雙胎7個），20個足月產，2個早產，2例流產。

（二）常規IVF部分受精失敗的R-ICSI周期（新鮮移植周期的胚胎來源均為R-ICSI）：共62個新鮮周期，32個新鮮移植周期，30個取消周期，共709個未受精卵，549個MII期卵子行補救ICSI，卵子再利用率為77.43%（549/709），51.61%（32/62）周期獲得移植。受精卵子數為467個，2PN受精卵子數為389個，卵裂數為456個，2PN卵裂數為382個，優質胚胎數為166個。受精率為85.06%（467/549），正常受精率為70.86%（389/549），卵裂率為97.64%（456/467），優胚率為43.46%（166/382）。總共移植61枚胚胎，孕囊數16個，種植率為26.23%（16/61）。臨床妊娠15例，共11位患者分娩，12個活產兒（單胎10個，雙胎1個），10個足月產，1個早產，2例流產，2例異位妊娠。

討 論

發生IVF受精失敗，會帶來沮喪感及繁重的經濟負擔。受精是一個復雜的進程，據報道，在常規IVF周期中，約3%-5%有受精失敗的風險[10]。據研究報道[11]，發生受精失敗的其中一個原因是由于精子未能與透明帶成功結合或未能穿越透明帶。R-ICSI可以通過機械穿透卵細胞膜而繞過生物學障礙，增加患者受孕機會，故在未取消該周期的情況下實施R-ICSI是一種值得嘗試的方法。另一種方案是取消當前IVF周期。相關研究表明[12，13]，與取消周期的方法相比，早R-ICSI是值得應用的補救方案，可獲得不錯的臨床妊娠結局。

高質量胚胎的產生需要高質量的配子，精子形態一直是生殖醫師評估男性生育力的重要實驗室參數，對成功受精具有重要影響。各種負面環境因素或內在因素都可能會影響精子形態，造成頭部、中段或尾部缺陷。學者們已對精子形態與IVF/ICSI結局的關系進行了大量的研究。史軼超等[14]研究發現精子形態完整性與IVF受精率、正常受精率、可移植胚胎率有關，但與活產率、流產率關系仍需進一步驗證。另一項研究[15]也提到，IVF受精率可因精子頭部畸形而下降。當NSMR≤4%時，IVF總體受精率降低，當NSMR≤3%時，IVF正常受精率下降。Li B等[7]則探討了不同精子形態在體外受精選擇方式上的作用，發現NSMR與胚胎發育潛能呈顯著正相關，認為當NSMR＜4%時，應首選ICSI進行輔助生殖助孕，而當NSMR≥4%，常規IVF助孕方案應優先選擇。Zahiri Z等[16]學者研究指出，在ICSI周期中，不同的精子形態（如大、小和無頂體）影響染色質的完整性及其凝聚，并降低精子的生育潛能及妊娠率。而一項關于2202個IVF周期和2574個ICSI周期的研究指出，在IVF/ICSI周期中，畸形精子癥對妊娠結局的影響是有限的，此外，IVF/ICSI出生缺陷風險沒有增加[17]。

然而，目前關于精子正常形態率對R-ICSI治療結局影響的研究，國內外鮮有文獻報道，且納入及排除標準不一。為此，本研究根據IVF受精失敗情況分為RICSI（TFF）及R-ICSI（PFF），再分別比較NSMR＜4%和NSMR≥4%的胚胎發育情況及臨床結局。結果發現，在R-ICSI（TFF）中，NSMR＜4%組與NSMR≥4%組的基本資料、胚胎發育情況及臨床結局均無顯著性差異。這與Li M等[18]學者研究報道一致，畸精癥對R-ICSI患者的臨床結局沒有影響。分析原因可能為：受精過程涉及到一系列蛋白反應和蛋白相互作用，精卵異常及二者之間相互作用蛋白的缺失或功能異常，均可導致受精失敗[19]。Anifandis G等[20]學者研究報道，與ICSI受精失敗相關的一個已知因素是卵母細胞激活缺陷，而精子磷脂酶Cζ亞型（phospholipase Cζ，PLCζ）蛋白缺失使它不足以產生鈣離子振蕩以激活卵母細胞。受精失敗的發生，還可能與精子、卵子自身功能缺陷有關，如精卵膜識別障礙、精卵膜融合缺陷、卵母細胞核成熟度及卵母細胞質缺陷等[21，22]。以上因素就有可能使原核形成失敗，從而導致受精失敗，與精子形態無顯著關系。另外，也可能是由于樣本量不足或受其他因素影響，如精子DNA損傷、卵子質量、活性氧水平及不良生活習慣等。

在R-ICSI（PFF）研究中，結果發現NSMR≥4%組受精率大于NSMR＜4%組，兩組比較差異有統計學意義（89.77%vs 82.04%）。這可能是因為精子形態正常時，頂體更完整，精子整體質量更好，受精過程更容易發生，受精率提高[23]。有研究[24]指出精子頂體反應是膜融合、水解酶以及基質蛋白釋放的生理分泌過程，使精子能夠穿透卵子透明帶。頂體內含透明質酸酶、頂體蛋白酶等與受精發生相關的水解酶，對精子穿透能力及受精能力有著關鍵影響作用。肖鑫等[25]探討精液質量對IVF與R-ICSI兩種輔助生殖方式的影響，指出當精子正常形態率＜1.4%，并結合DNA斷裂率、頂體完整性及頂體反應率等指標時可優先選擇行R-ICSI助孕，相較于IVF具有更好的臨床結局。何泳志等[26]研究指出精子頂體完整率高更有益于R-ICSI妊娠結局。頂體是精子的重要組成部分，存在異常形態結構時，易致頂體反應發生障礙而使男性不育，影響精卵相互作用[27]。同時，雖然R-ICSI可人為挑選相對正常形態的精子進行治療，但仍會不可避免的受到畸形精子的影響，這種“畸形”不僅存在于精子形態上，更體現在人為不能及時評估的“畸形”上，如內部超微結構的損傷、染色體微缺失等，而正是由于精子形態的正常性，使遺傳物質及頂體的完整性得以有效保障，降低精卵識別失敗率，從而改善了助孕結局。

常規IVF受精失敗后行R-ICSI治療，在生殖臨床中已被廣泛應用。它不僅給患者再次受精的希望，而且妊娠結局情況更可為生殖醫師給患者制定下一周期的診療方案提供建設性意見。為探討R-ICSI臨床應用價值，本研究對IVF完全受精失敗或部分受精失敗兩種情況進行分類統計，發現在兩種情況下，R-ICSI均可獲得不錯的妊娠結局，避免IVF周期取消。這與既往學者研究所得結論相一致。如鄭娟等[28]學者、Huang B等[29]學者均指出R-ICSI在IVF完全受精失敗中具有巨大的臨床應用價值，是一種安全的補救方法，臨床結局與常規ICSI無明顯差異。Cao S等[30]研究發現當IVF受精率小于25%時行R-ICSI更值得推薦。Xiong F等[31]分析比較早期R-ICSI與常規ICSI妊娠結局和新生兒結局，發現并無顯著差別，R-ICSI提供了一種安全有效的替代方案。羅平等[32]學者對IVF完全不受精或低受精行早期R-ICSI進行研究，指出補救ICSI在兩種情況下，均值得臨床應用推薦，是一種較好的補救措施。而本研究在數據更充足的前提下，詳細對比分析了多種臨床結局指標，在既往研究的基礎上更明確了無論在何種情況下（TFF/PFF），補救ICSI均值得推薦使用，可避免無胚胎可移。綜上，筆者認為精子正常形態率是評估男性生育力不可忽視的重要因素，可在一定程度上影響早期胚胎發育，R-ICSI是解決IVF受精失敗的良策，可優先選擇ICSI作為補救方案。