小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1表達及臨床意義*

彭潛龍 田 穩(wěn) 李創(chuàng)業(yè) 聶有能 趙夭望

湖南省兒童醫(yī)院 泌尿外科（湖南 410000）

尿道下裂（Hypospadias）是由于前尿道發(fā)育異常，尿道開口達不到正常位置，是小兒泌尿生殖系統(tǒng)疾病最常見的畸形之一，常伴有陰莖短小、下彎，使患兒不能站立排尿，甚至影響患兒成年后性功能和生育能力，嚴重影響患兒的身心健康。尿道下裂唯一的治療方法是手術(shù)矯正，但伴有較高的并發(fā)癥發(fā)生率，近年來，尿道下裂發(fā)病率高達0.4%，且仍有上升的趨勢，抗雄激素物質(zhì)或雌激素是導(dǎo)致尿道下裂的一個重要原因[1,2]。因此，尋找與小兒尿道下裂有關(guān)的生物標(biāo)志物，對改善患兒生活質(zhì)量具有重要意義。環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是一種誘導(dǎo)酶，正常生理情況下處于不表達或低表達，但在一些病理情況下高表達，大量研究表明，在細胞受到炎癥因子、化學(xué)藥物、癌基因等刺激時COX-2被迅速合成，從而參與炎癥反應(yīng)、組織損傷、腫瘤的發(fā)生等，此外有研究報道，孕激素可刺激COX-2高表達，隨后COX-2誘導(dǎo)合成過量雌激素，從而促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[3,4]。但關(guān)于COX-2在尿道下裂患兒包皮組織中的表達情況研究較少。金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP1）為基質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的 天然抑制劑，MMPs在人體內(nèi)廣泛分布，參與血管形成、胎膜破裂、胚泡植入、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、內(nèi)分泌失調(diào)等病理生理過程。TIMP1能夠和MMPs特異性結(jié)合，阻斷MMPs激活過程，阻礙MMPs與底物結(jié)合，抑制MMPs發(fā)揮降解作用，從而使睪酮等分泌異常，使機體內(nèi)分泌紊亂動態(tài)平衡遭到破壞，從而引發(fā)一系列病理生理變化[5,6]。但是關(guān)于TIMP1在尿道下裂患兒包皮組織中的表達方面的研究較少，本研究采用免疫組化法檢COX-2、TIMP1在小兒尿道下裂患者包皮組織中的表達情況，并探討其與小兒尿道下裂之間的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年6月至2021年6月在我院泌尿外科收治的小兒尿道下裂患者151例為尿道下裂組，年齡5～11歲，平均年齡（6.91±1.62）歲；另選取71例尿道外口正常者為正常對照組，年齡4～12歲，平均年齡（7.48±1.59）歲；根據(jù)陰莖伸直后尿道外口位置將尿道下裂組患兒分為輕型組48例（陰莖遠側(cè)型、冠狀溝型、陰莖頭型）、中型組50例（后2/3陰莖干型）、重型組53例（會陰型、陰囊型、陰莖陰囊型）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床上通過典型的臨床表現(xiàn)和泌尿系的B超檢查等確診為尿道下裂；②無手術(shù)矯正史；③無兩性畸形或者其他系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并尿道下裂以外的生殖器畸形；②合并其他器官的畸形和內(nèi)分泌的異常；③臨床資料不全。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：HCHLL-2020-47），所有受試者及其監(jiān)護人對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

兔抗人COX-2、TIMP1抗體、羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程公司；顯微圖像采集系統(tǒng)購自Nikon生物顯微鏡&SPOT成像系統(tǒng)，石蠟切片機購自英國SHANDON公司，雙目光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，分光光度儀購自美國GretagMacbeth公司。

三、標(biāo)本采集

取小兒尿道下裂患者手術(shù)后留取的包皮組織，同時留取陰莖發(fā)育正常包皮環(huán)切手術(shù)者的包皮組織，分別標(biāo)記后放于-80℃中保存，待測。

四、免疫組織化學(xué)法檢測組織中COX-2、TIMP1表達

取出標(biāo)本并進行切片，處理后分別滴加兔抗人COX-2（1:400）、TIMP1（1：400）抗體作為一抗，4℃過夜，用PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1:1000），用PBS清洗3次，之后滴加DAB顯色進行染色，嚴格按照說明書操作，5-10min后用顯微鏡觀察染色情況，COX-2、TIMP1表達均為包皮組織真皮層纖維細胞胞漿內(nèi)和/或胞膜，以細胞胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性。

五、結(jié)果判定

使用光學(xué)顯微鏡觀察，分別對和正常對照組中每張切片隨機挑選并對COX-2、TIMP1陽性細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。①根據(jù)陽性百分率＜6%為0分、7%～29%為1分、29%～49%為2分、49%以上為3分。②根據(jù)著色強度：0分為無著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色，③根據(jù)二者乘積得到總分：≤3分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+）；6～8分為中度陽性（++）；9～10分為強陽性（+++），+～+++均為陽性表達。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)描述，計數(shù)資料采用[n（%）]進行描述，三組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman法分析小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的相關(guān)性，Logistic回歸分析與尿道下裂發(fā)生的有關(guān)因素，以P＜0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、COX-2、TIMP1在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

正常對照組包皮組織COX-2表達陽性19例，陰性52例，尿道下裂患者包皮組織COX-2表達陽性121例，陰性30例，小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽性表達率高于正常對照組（P＜0.05）；正常對照組包皮組織TIMP1表達陽性48例，陰性23例，尿道下裂患者包皮組織表達陽性38例，陰性113例。小兒尿道下裂患者中包皮組織TIMP1的陽性表達率低于正常對照組（P＜0.05），詳見表1，圖1。

表1 COX-2在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

圖1 免疫組化圖

二、不同程度小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的表達情況比較

小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽性表達率：重型組＞中型組＞輕型組（P＜0.05），TIMP1的陽性表達率：輕型組＞中型組＞重型組（P＜0.05），詳見表2。

表2 COX-2在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

三、小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關(guān)性

小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2與TIMP1的表達有關(guān)（r=-0.514，P＜0.05），詳見表3。

表3 小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關(guān)性

四、二元Logistic回歸分析小兒尿道下裂影響因素

將是否發(fā)生小兒尿道下裂作為因變量，以雌二醇、睪酮、包皮組織COX-2、TIMP1陽性表達作為水平自變量，進行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示雌二醇、睪酮、COX-2、TIMP1水平與小兒尿道下裂的發(fā)生有關(guān)（P＜0.05），詳見表4。

表4 尿道下裂的影響因素分析

討 論

尿道下裂是兒童較為常見的泌尿生殖道先天畸形，約占新生男嬰的0.3%-0.5%，僅次于先天性心臟病，且近年來仍然呈上升趨勢，尿道下裂的病因涉及遺傳因素、環(huán)境因素、激素調(diào)控、基因突變等，妊娠早期母體接觸農(nóng)藥、輻射、吸煙（被動）等都可能會增加尿道下裂的發(fā)生率。尿道下裂的病因和發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前僅有低于5%的患兒能找到確切的發(fā)病原因，但對于大多數(shù)的尿道下裂患兒的病因仍然不是很了解，因此，尋找與小兒尿道下裂有關(guān)的生物標(biāo)志物，對改善患兒生活質(zhì)量具有重要意義[7,8]。

COX-2是經(jīng)過細胞因子等誘導(dǎo)下表達，與炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cox-2在多種癌組織，如子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌呈高表達[9,10]。Ellen[11]等詳細介紹了COX-2在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域中的作用，在內(nèi)膜異位癥患者腺上皮中COX-2的表達高于正常婦女，提示COX-2的表達與內(nèi)膜異位的發(fā)生有關(guān)。梁金紅[12]研究結(jié)果表明，COX-2子宮內(nèi)膜癌中呈高表達，提示COX-2在子宮內(nèi)膜癌的病理生理過程中起重要作用。楊勇波[13]等研究結(jié)果表明，宮頸癌組織中COX-2呈高表達，且與化療敏感性密切相關(guān)，可用于宮頸癌病人新輔助化療治療前化療敏感性的預(yù)測。妊娠早期母體的雌激素干預(yù)可引發(fā)胎兒發(fā)生先天性尿道下裂，COX-2可能參與了雌激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其與小兒尿道下裂的發(fā)生有關(guān)[7]，本研究結(jié)果表明，與對照組比較，小兒患者COX-2陽性表達率升高，且COX-2陽性表達率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而升高，提示COX-2可能在尿道下裂的發(fā)生中發(fā)揮一定的作用，與尿道下裂的嚴重程度密切相關(guān)，推測COX-2表達可能誘導(dǎo)雌激素分泌，通過介導(dǎo)雌激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了小兒尿道下裂的發(fā)生發(fā)展過程；多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明COX-2是小兒尿道下裂患者發(fā)生的危險因素，提示COX-2可能與尿道下裂的發(fā)生具有一定的關(guān)系。

TIMP-1是一種相對分子質(zhì)量28000的糖蛋白，能夠與活化的間質(zhì)膠質(zhì)酶、間質(zhì)溶解素、MMP-9以非共價鍵形成復(fù)合物，抑制酶原的活化[14]。周琦[15]等研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥組織中TIMP-1與侵襲程度呈負相關(guān)，TIMP-1隨著子宮內(nèi)膜異位癥臨床分期的升髙而降低，提示人工誘導(dǎo)TIMP-1表達可能抑制內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。滿冬梅[16]等研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中TIMP-1 mRNA的表達下調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達上調(diào)，TIMP-1降低了對MMP-9的抑制作用，從而使異位內(nèi)膜細胞具有更強的侵襲能力以及異位種植能力，提示TIMP-1、MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過程中起極其重要的作用。尿道下裂由于胎兒內(nèi)分泌紊亂主要是雙氫睪酮和睪酮的分泌紊亂而發(fā)生疾病，TIMP-1的異常表達可能是一種繼發(fā)性改變從而致使小兒尿道異位形成尿道下裂[7]。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，小兒尿道下裂患者TIMP1陽性表達率降低，且TIMP1陽性表達率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而降低，提示TIMP1能反映小兒尿道下裂患者病情的嚴重程度，推測TIMP-1低表達可能減少了對MMP的激活，無法降解睪酮等激素，使機體睪酮等激素水平異常發(fā)生內(nèi)分泌紊亂平衡失調(diào)，從而參與小兒尿道下裂的發(fā)生發(fā)展過程；經(jīng)Pearson法分析小兒尿道下裂患者COX-2、TIMP1表達呈負相關(guān)，提示COX-2、TIMP1可能共同參與疾病發(fā)生發(fā)展，多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明TIMP1是小兒尿道下裂患者發(fā)生的危險因素，提示TIMP1的異常表達可能在尿道下裂發(fā)展演變存在一定關(guān)系。

綜上所述，COX-2、TIMP1表達情況可能與尿道下裂的發(fā)生發(fā)展演變有關(guān)，有望成為尿道下裂潛在的研究靶點。