山東省部分規模化驢場主要病原感染情況調查

高星熠，丁召亮，顏 恒，張 偉，朱曼玲

（1.山東中醫藥大學，山東濟南 250100；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；3.山東東阿黑毛驢牧業科技有限公司，山東東阿 252200；4.章丘區相公街道畜牧獸醫站，山東濟南 250203；5.農業農村部畜禽生物組學重點實驗室，山東濟南 250100）

近年來，隨著驢的勞動功能向肉、皮、奶轉移，我國的驢養殖數量也不斷增加，現代大規模、集約化驢養殖場越來越多。但在一些地區，驢和牛、羊一起飼養，且飼養家畜頻繁異地采購，跨區域運輸，大大增加了疾病暴發和流行風險。目前，驢疫病的基礎和應用研究薄弱，驢疫病病原體變異和傳播的風險評估體系尚未建立，驢疫病綜合防控服務體系不健全。對驢的呼吸系統疾病、感染性腹瀉和流產的綜合防治研究滯后，迫切需要一套完善的健康養殖保健技術規范，為驢養殖的產業化和可持續發展提供技術支持。目前國內尚未大規模開展規模化驢場疫病種類及其流行情況的流行病學調查，缺乏驢疫病流行病學數據，這對制定馬屬動物疫病防控策略造成了障礙。

近年來，山東省建立了200 多個規模化養驢場和扶貧驢場。在驢養殖密度越來越高、流動更為頻繁的背景下，一旦發生疫病，將會給養驢產業造成嚴重經濟損失。為了解山東省驢群中流行的主要病原，2019—2021 年在山東省驢養殖密集區的9個規模化驢場，對引發腹瀉、肺炎和流產的主要病原[1]感染情況進行了調查，以期豐富山東省驢疫病的流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品采集 2019—2021 年，從聊城、德州、濱州等地的9個規模化驢場（繁殖母驢100頭以上），無菌采集表現不同癥狀病死驢（駒）的心、肝、脾、肺、腸、腎等臟器病料共計742 份（表1）；隨機采集臨床健康驢血液樣品296 份，頸靜脈無菌采血，每頭驢采血量不少于 3 mL，裝入滅菌瓶中，帶回實驗室分離血清。

表1 不同臨床癥狀的病料組織樣品采集情況 單位：份

1.1.2 主要試劑耗材 PBS 緩沖液、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、DL-2 000 DNA Marker，均購自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，購自北京全式金生物技術有限公司；FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 柱 式DNA/RNA 共提取試劑盒、M-MLV（H-）Reverse Transcriptase 逆轉錄試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；虎紅試劑以及布魯氏菌陰陽性對照血清，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品處理 臟器病料組織勻漿：稱取0.2～0.5 g 病料組織塊，用預冷的生理鹽水沖洗后，放入離心管中，用小剪子剪碎；加入組織研磨專用鋼珠和預冷的生理鹽水，用高通量組織研磨器10 000～15 000 r/min 研磨制成10%組織勻漿，-80 ℃保存，用于提取樣品的RNA 和 DNA。腹瀉癥狀樣品檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和輪狀病毒，肺炎癥狀樣品檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、馬流感病毒和馬皰疹病毒，流產癥狀樣品檢測大腸桿菌、沙門氏菌、馬皰疹病毒和馬動脈炎病毒。血清制備：將非抗凝血液，室溫或37 ℃環境下傾斜放置，待血液凝固后，3 000 r/min 離心 5～10 min，上清液即為血清，小心將上清吸出，-20 ℃保存備用。

1.2.2 樣品DNA 提取 按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit 試劑盒說明書，進行病料組織勻漿的DNA 提取。

1.2.3 樣品PCR 檢測 以提取的樣品DNA 為模板，以大腸桿菌、沙門氏菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌的特異性引物（表2）進行PCR 擴增。反應體系（25.0 μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.0 μL，上下游引物各（10 mmol/L）1.0 μL，模板1.5 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環；72 ℃延伸8 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

表2 細菌鑒定引物信息

1.2.4 樣品RNA 提取 按照FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 柱式DNA/RNA 共提取試劑盒說明書，進行病料組織勻漿的DNA/RNA 共提取。

1.2.5 RT-PCR 檢測 按照M-MLV（H-）Reverse Transcriptase 逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄后，對馬皰疹病毒、馬流感病毒和馬動脈炎病毒和輪狀病毒進行PCR 擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。引物序列見表3[2-5]。

表3 病毒鑒定引物信息

1.2.6 血清樣品檢測 按照虎紅平板凝集試驗說明書，對樣品血清進行虎紅平板凝集試驗（RBPT），檢測布魯氏菌感染抗體。在陰、陽性對照血清成立時，方可進行樣品血清的結果判定。血清在5 min內出現凝集現象，判定為陽性（+），無凝集現象，呈均勻一致粉紅色，判定為陰性（-）。

2 結果與分析

2.1 病料樣品PCR 檢測

3 年的統計結果（表4）顯示：在腹瀉癥狀樣品中，檢出大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和輪狀病毒，檢出率分別為48.89%、21.85%、11.48%和10.37%；在肺炎癥狀樣品中，檢出肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、馬流感病毒和馬皰疹病毒，檢出率分別為29.82%、24.10%、22.29%、2.41%、12.65% 和1.81%；在流產癥狀樣品中，檢出沙門氏菌、大腸桿菌和馬皰疹病毒，檢出率分別為44.29%、18.57%和3.57%。所有流產臨床癥狀樣品中均未檢出馬動脈炎病毒。

表4 不同病原的陽性檢出率 %

2.2 混合感染結果統計

檢測發現，同一樣品中存在混合感染情況（表5），主要表現為大腸桿菌與其他病原的混合感染。

表5 混合感染陽性檢出率 %

2.3 血液樣品布魯氏菌抗體檢測

對296 份血液樣品進行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗，未檢出抗體陽性。

3 討論

調查發現，目前危害山東省驢場生產的最主要疫病是細菌病，而條件性致病菌是主要病原，其發生率多數與驢舍環境、養殖密度、飼料質量和管理水平等有直接關系。細菌病給驢的規模化養殖帶來巨大經濟損失，因此規模化養殖條件下如何科學防控細菌病值得關注[6-11]。細菌性病原導致的腹瀉在驢養殖場普遍發生，主要致病菌是大腸桿菌。大腸桿菌不僅是引起腸炎和敗血癥的主要病原，也是引起驢駒嚴重腹瀉、肺炎，造成驢駒大量死亡的病因，病死率為15%～20%[12]。1982 年，河南省發生了大規模馬屬動物腹瀉疫情，41 374 只馬屬動物中，有437 只發病，發病率為1.1%，死亡319 只，死亡率為73%，疫情的發生與飼養管理條件差密切相關，加上天氣變化導致消化道內菌系失調，致病性大腸桿菌急劇增殖產生大量毒素，最終因敗血癥而死亡[13]。2015—2018 年研究[12]發現，位于山東、新疆、遼寧和內蒙古的49 個規模驢場4 755頭驢駒的腹瀉發病率為67.3%，病原為大腸桿菌。這與本調查得出的大腸桿菌為腹瀉主要病原的結果一致。

調查發現，在流產癥狀樣品中，最主要的致病菌是沙門氏菌。研究[14]發現，造成2013—2014年新疆地區2 768 匹馬發生流產的主要病原也是馬流產沙門氏菌。近年來，歐美國家由于嚴格的養殖衛生政策，馬流產沙門氏菌病發生率得到了很好的控制，但是該疾病在非洲和亞洲國家的馬屬動物中很常見，仍然是一個急需解決的問題[15-19]。

調查發現，不同癥狀樣品中存在一定的病原混合感染，主要為大腸桿菌與其他病原的雙重混合感染。混合感染可以加重病情，并導致出現復雜臨床癥狀，這給疾病防治增加了困難。

本調查未檢測出布魯氏菌陽性抗體，表明山東省規模化驢場布魯氏菌流行率較低，同時也說明布魯氏菌并非導致驢流產的主要病原。

當前，對細菌病的預防與治療更應注重科學[20-23]。對于細菌病的預防，必須加強飼養管理，保證驢舍良好的環境條件，同時也可以通過接種疫苗來降低疾病發生風險。在治療方面，細菌病主要通過抗生素藥物進行治療，但細菌極易產生耐藥性，因此需要科學合理用藥。在臨床治療中，建議用藥前通過藥敏試驗篩選敏感抗生素類藥物，同時配合中藥以及噬菌體和益生菌等進行輔助治療[24-28]。

4 結論

調查發現，導致山東省規模驢場發生腹瀉、肺炎和流產的主要是條件性致病菌，其中導致腹瀉的主要是大腸桿菌，肺炎的主要是大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和馬鏈球菌，流產的主要是沙門氏菌。因此，規模化驢場應通過加強飼養管理，提高養殖舍衛生水平，科學使用抗生素等措施，控制細菌性疫病流行。