廈門市寵物犬貓中布魯氏菌、弓形蟲、A 型流感病毒及巴爾通體的流行病學(xué)調(diào)查

趙 冉，蔡振鴻，陳 瓊，陳永鋒，連玉華，夏馥麗，徐 麗

（1.廈門市動物疫病預(yù)防控制中心，福建廈門 361009；2.廈門市思明區(qū)市政中心，福建廈門 361005）

布魯氏菌、剛地弓形蟲、A 型流感病毒及巴爾通體是重要的人獸共患病病原。布魯氏菌主要引起感染動物生殖器官炎癥及繁殖障礙。犬貓不僅可感染粗糙型犬種布魯氏菌，亦可感染光滑型羊種、牛種和豬種布魯氏菌[1-2]。弓形蟲主要引起感染動物眼病、肝病、肺炎、心包心肌炎和流產(chǎn)[3-4]。貓既是弓形蟲的終末宿主，又是中間宿主。動物感染A 型流感病毒后以打噴嚏、咳嗽、發(fā)熱及呼吸困難為主要癥狀，已證實(shí)H3N8、H3N2、H5N1、H5N2、H1N1、H9N2、H10N8 和H6N1 等亞型均可感染犬貓[5-8]。巴爾通體主要引發(fā)菌血癥、淋巴結(jié)炎癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肝炎、脾炎、關(guān)節(jié)炎以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，在犬貓中已檢出漢賽巴爾通體、克氏巴爾通體、文森巴爾通體伯格霍夫亞種等多種巴爾通體[9-11]。

隨著城市化發(fā)展，廈門市寵物犬貓飼養(yǎng)量與日俱增。犬貓作為伴侶動物常與免疫力低下的兒童、孕婦及老年人密切接觸，且又是布魯氏菌、弓形蟲、流感病毒、巴爾通體等人獸共患病病原的易感動物，存在感染并傳染人的風(fēng)險(xiǎn)，具有潛在的公共衛(wèi)生隱患。本研究采集廈門市寵物犬貓樣品進(jìn)行上述4 種人獸共患病病原檢測，旨在初步了解其在本地寵物犬貓中的流行現(xiàn)狀，從而為本地人獸共患病防治及公共衛(wèi)生安全保障提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群體

本研究以廈門市動物診療機(jī)構(gòu)接診的寵物犬貓為目標(biāo)群體。

1.2 樣品采集

2021 年10—11 月，遵循流行病學(xué)調(diào)查抽樣原則，采用先抽群體再抽個體的策略，從廈門市備案的70 家動物診療機(jī)構(gòu)中，隨機(jī)抽取35 家，每家抽取5 只犬和5 只貓。按便利抽樣原則，每家診療機(jī)構(gòu)從準(zhǔn)備抽樣開始計(jì)算，接診的前5 只犬或貓作為樣本，不同年齡、不同性別，以及圈養(yǎng)與放養(yǎng)、臨床健康狀況等均為隨機(jī)抽樣。在征得主人同意的情況下進(jìn)行樣品采集，每只犬貓對應(yīng)采集1 份血液及1 份抗凝全血，均為3～5 mL。血液置4 ℃冰箱過夜后分離血清用于抗體檢測，抗凝全血直接用于核酸檢測。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR 儀，型號 QuantStudio 6 Flex，美國ABI 公司產(chǎn)品；小型臺式冷凍離心機(jī)，型號MIKRO 220R，德國HETTICH 公司產(chǎn)品；核酸提取儀，型號 KINGFISHER，Thermo 公司產(chǎn)品；自動洗板機(jī)，型號Hydroflex，瑞士TECAN 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，型號iMark，美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品。

1.4 主要試劑

Premix ExTaqTM（Probe qPCR），購自大連寶生物；核酸提取試劑，購自南京中科拜爾公司；引物、探針及陽性質(zhì)粒序列（表1），均由生工生物公司合成；禽流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑，購自青島立見生物技術(shù)有限公司；犬種布魯氏菌IELISA 抗體檢測試劑，購自哈爾濱平河試劑公司；A 型流感病毒抗體檢測試劑（IDEXX）及弓形蟲ELISA 抗體檢測試劑盒（ID.vet），購自福州默沙東公司；禽流感H5 亞型（Re-11/Re-12 株）、H7亞型（Re-3 株）、H9 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原及陰陽血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.5 檢測方法

1.5.1 抗體檢測 本研究選用的布魯氏菌檢測試劑可同時(shí)檢測平滑型及粗糙型布魯氏菌抗體，敏感性（Se）為99.5%，特異性（Sp）為99.0%；弓形蟲試劑的陽性血清判讀，按S/P≥70%計(jì)算，敏感性（Se）為95.0%，特異性（Sp）為98.0%；A型流感病毒ELISA 試劑敏感性（Se）為95.3%，特異性（Sp）為99.6%。A 型流感病毒H5、H7、H9 亞型抗體檢測，按血凝抑制試驗(yàn)（國標(biāo)法）進(jìn)行，抗體滴度≥4log2 判為陽性。

1.5.2 核酸檢測 犬貓A 型流感病毒核酸檢測，參照試劑盒說明書進(jìn)行。布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體的核酸檢測，應(yīng)用廈門市動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室建立的布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體三重?zé)晒釶CR 法進(jìn)行，其敏感性（Se）為99.0%，特異性（Sp）為99.5%（文章待發(fā)表）。總反應(yīng)體系20.0 μL：2×Premix ExTaqTM（Probe qPCR）10.0 μL，BF、BR 各0.5 μL，BP 1.0 μL；GF、GR 各0.7 μL，GP 1.4 μL，SF、SR 各0.3 μL，SP 0.6 μL，待檢核酸4.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、58 ℃ 60 s，40 個循環(huán)，58 ℃時(shí)進(jìn)行FAM、ROX 和JOE 三個通道的熒光信號搜集。結(jié)果判定：Ct 小于35，判為陽性；Ct 大于40，判為陰性；介于兩者之間判為可疑，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，如結(jié)果一致且有明顯的對數(shù)增長曲線，判為陽性。

1.6 病例定義

陽性樣品（個體）：布魯氏菌、弓形蟲、A型流感病毒檢測采用平行試驗(yàn)策略，即樣品中無論抗體陽性還是核酸陽性，均判為陽性個體。巴爾通體核酸陽性定義為巴爾通體陽性個體。

1.7 流行率估計(jì)

表觀流行率（AP）：AP=陽性樣品數(shù)/抽檢樣品數(shù)。

真實(shí)流行率（TP）：TP=（AP+Sp-1）/（Se+Sp-1）。式中：Se 為布魯氏菌、弓形蟲、A型流感病毒平行試驗(yàn)的敏感性，均為100%，巴爾通體為熒光PCR 試驗(yàn)的敏感性；Sp 為布魯氏菌、弓形蟲、A 型流感病毒平行試驗(yàn)的特異性，分別為98.5%、97.5%和99.1%，巴爾通體為熒光PCR 試驗(yàn)的特異性。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集

原計(jì)劃從備案的70 家寵物診療機(jī)構(gòu)中抽檢35家寵物診療機(jī)構(gòu)，因受疫情影響，實(shí)際僅完成32家的樣品采集。計(jì)劃每家隨機(jī)抽取5 只犬和5 只貓，實(shí)際共抽取304 只犬貓，其中犬172 只、貓132 只。共收集到犬貓全血及抗凝全血各304 份。經(jīng)詢問，所采集的304 只犬貓均無布魯氏菌、弓形蟲、流感病毒及巴爾通體免疫背景。

2.2 血清學(xué)檢測

304 份犬貓血清中，共檢出6 份布魯氏菌抗體陽性，表觀流行率為2.0%，真實(shí)流行率為0.5%（95%CI：0～1.3%）。其中：檢出犬陽性4 份，陽性率為2.3%；貓陽性2 份，陽性率為1.5%。

共檢出10 份弓形蟲抗體陽性，表觀流行率 為3.3%，真實(shí)流行率為0.8%（95%CI：0～1.8%）。其中：檢出犬陽性5 份，陽性率為3.0%；貓陽性5 份，陽性率為3.8%。

共檢出26 份A 型流感病毒抗體，表觀流行率為8.6%，真實(shí)流行率7.7%（95%CI：4.7%～10.7%。其中檢出犬陽性23 份，陽性率為13.4%；檢出貓陽性3 份，陽性率為2.3%；檢出H9 亞型抗體陽性19 份，抗體滴度為4log2～6log2，未檢出H5 亞型及H7 亞型抗體陽性（抗體滴度＜1log2）。

4 份犬血清樣品中，同時(shí)檢出A 型流感病毒及布魯氏菌抗體陽性。

2.3 核酸檢測

304 份犬貓全血中均未檢出布魯氏菌、弓形蟲、巴爾通體及A 型流感病毒核酸。

3 討論

廈門市寵物犬貓的人獸共患病研究尚在起步階段，未見布魯氏菌、流感病毒及巴爾通體的流行病學(xué)報(bào)道。此次調(diào)查彌補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白，為本地寵物人獸共患病防控提供了參考。巴爾通體為新發(fā)病病原，至少有30 多個種或亞種。A 型流感病毒血清型較多，其中H5、H7 亞型具有高致病性，可以感染人。另外，本地家禽中的H9 亞型檢出率也較高[15-16]，且該亞型亦可感染人，因此對A 型流感病毒抗體的陽性樣品進(jìn)行了H5、H7、H9 亞型的分型鑒定。

4 種病原的真實(shí)流行率由高到低依次為A 型流感病毒（7.7%）、弓形蟲（0.8%）、布魯氏菌（0.5%）、巴爾通體（0），表明A 型流感病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)較高，但未檢出高致病性的H5 和H7 亞型。流感病毒抗體檢測數(shù)據(jù)顯示，寵物犬抗體陽性率為13.4%，遠(yuǎn)高于寵物貓（2.3%）。寵物犬貓H9 亞型陽性率占總陽性的73.1%，未檢測到高致性H5 及H7 亞型抗體。近幾年對H9 亞型的研究[15-16]表明，該亞型有感染人發(fā)病且毒力增強(qiáng)的趨勢。本地犬貓中H9亞型檢出率較高，提示其存在潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。

本地寵物犬貓中弓形蟲抗體陽性率分別是3.0%和3.8%，與2018—2019 年福州市犬（4.14%）、貓（2.71%）的弓形蟲抗體陽性率以及2019—2020廈門市寵物犬（4.68%）、貓（4.71%）的弓形蟲抗體陽性率接近，說明本地犬貓?jiān)斐晒蜗x地方性流行的可能性較低，但由于存在感染人的潛在風(fēng)險(xiǎn)，建議持續(xù)監(jiān)測。

粗糙型布魯氏菌和光滑型布魯氏菌均可感染人，粗糙型致病性高于光滑型。本研究檢測的布魯氏菌抗體包括粗糙型和光滑型，表觀流行率為2.0%，真實(shí)流行率為0.5%，流行率較低。這與廈門城市化發(fā)展和生活質(zhì)量的改善密切相關(guān)。本地寵物犬貓多圈養(yǎng)于家中，較少與豬牛羊等家畜接觸，且多飼喂貓糧、狗糧等成品飼料，食生肉感染的概率不高。

近幾年北京、上海、山東等地的犬貓血液中先后檢出巴爾通體[9-11，13-14]，福建省在鼠中檢出巴爾通體[12]，在廈門市海滄區(qū)人群中亦檢出巴爾通體[2]，因此有必要對當(dāng)?shù)貙櫸锶堖M(jìn)行該病原的檢測。本次抽檢的304 份寵物犬貓血液中均未檢出巴爾通體陽性核酸，提示目前本地寵物犬貓中此種病原的感染率不高。但巴爾通體在鼠類中的檢出率較高，因此不能排除本地流浪犬貓感染或攜帶巴爾通體的可能。因此，應(yīng)避免人或者家養(yǎng)犬貓與流浪犬貓接觸，切斷傳播途徑，防止該病的發(fā)生與傳播。

本調(diào)查覆蓋全市46%的寵物診療機(jī)構(gòu)，完成304 只犬貓的初步流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查結(jié)果在一定程度上反映了2021 年廈門市寵物犬貓中這4 種病原的感染情況，雖未檢測到核酸，但證實(shí)寵物犬貓中存在流感病毒、弓形蟲及布魯氏菌陽性抗體，因此需引起畜主及防控機(jī)構(gòu)的重視。

今后應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)寵物中這4 種病原的監(jiān)測，同時(shí)加大防控宣傳力度，提高寵物飼養(yǎng)者的認(rèn)知水平，提升個人防護(hù)意識，做好犬貓的飼養(yǎng)管理、糞便處理、犬貓舍清洗消毒，以降低寵物疾病的發(fā)生和潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。