不同劑量包蟲病基因工程亞單位疫苗EG95免疫牦牛后的抗體水平測定

李盛瓊，楊光友，李徳珍，陳和強(qiáng)，華瑞其，高 露，尹 杰，袁東波，楊天俊，黃雅琳，魏秋霞，陽愛國，侯 巍

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；3.道孚縣動物疫病預(yù)防控制中心，四川道孚 626400；4.甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心，四川甘孜 626700；5.富順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川富順 643200；6.雅安市養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，四川雅安 625000）

包蟲?。蝌什。┦怯杉?xì)粒棘球絳蟲寄生于動物（人）的肝臟、肺臟等器官引起的一種人獸共患病，嚴(yán)重影響我國畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康[1-3]，我國將其列為二類動物疫病進(jìn)行防控。包蟲病主要流行于我國北方和西南地區(qū)，其中西南地區(qū)主要集中于高海拔農(nóng)牧區(qū)。經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對滯后，基層動物防疫體系薄弱，是造成包蟲病流行的主要因素[4]。四川省是牦牛養(yǎng)殖大省，截至2021 年末，全省包蟲病疫區(qū)縣共存欄牦牛420.6 萬頭，牦牛存欄量大，疫苗需求量也大。為探索更為科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的免疫方案，本研究開展了不同劑量包蟲病基因工程疫苗EG95 免疫牦牛的效果試驗(yàn)，使用間接ELISA血清抗體檢測方法，評價了不同免疫劑量對牦牛包蟲病的保護(hù)效果，以期為四川省乃至全國的牦牛包蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 選取甘孜州道孚縣玉科鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶1 歲左右未免疫包蟲病疫苗牦牛50 頭，隨機(jī)平均分為A、B、C、D、E 5 組，每組10 頭，在同等生產(chǎn)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.1.2 試驗(yàn)疫苗 包蟲病基因工程疫苗EG95（批號2021007-1），每頭份含有EG95 抗原50 μg，購自重慶澳龍生物制品有限公司。

1.1.3 儀器和試劑 96 孔酶標(biāo)儀，購自Bio-Rad公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，購自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；微量移液器，購自Transferpette 公司；一次性移液器吸頭，購自Axygen 公司；牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗體檢測試劑盒（批號20211004），購自重慶澳龍生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同劑量免疫 采取頸部皮下注射方式，分別按照1、2、3、4、5 頭份劑量對A、B、C、D、E 5 組試驗(yàn)牦牛進(jìn)行免疫，間隔28 d 后同等劑量二免。免疫后觀察牦牛有無嘔吐、抽搐、休克等應(yīng)激反應(yīng)和過敏反應(yīng)，同時監(jiān)測牦牛的體溫變化。首免前及二免后15 d 分別采集試驗(yàn)組牦牛血液分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清抗體檢測 采用間接ELISA 方法對試驗(yàn)血清進(jìn)行IgG 檢測，按照牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定：當(dāng)樣品OD450nm≤0.3 時，判定為所檢樣品對細(xì)粒棘球蚴（包蟲）感染無保護(hù)力；當(dāng)0.3 ＜樣品OD450nm≤0.6 時，判定為所檢樣品抗體水平較低，保護(hù)力低下；當(dāng)樣品OD450nm＞0.6 時，判定為所檢樣品抗體水平較高，有較強(qiáng)保護(hù)力。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫應(yīng)激反應(yīng)

首次免疫后，試驗(yàn)D 組、E 組牦牛在免疫后1 d 分別有1 頭牦牛出現(xiàn)精神沉郁、不愿走動、采食量下降等免疫應(yīng)激癥狀，免疫部位未發(fā)生潰爛，上述2 頭牦牛分別在免疫后2、3 d 恢復(fù)正常；所有試驗(yàn)牦牛免疫1 周內(nèi)體溫?zé)o明顯變化，無試驗(yàn)動物死亡情況。

二次免疫后，5 組試驗(yàn)牦牛的呼吸、精神、采食等指標(biāo)均無明顯變化，所有試驗(yàn)組動物免疫1 周內(nèi)體溫?zé)o明顯波動。

2.2 免疫抗體陽性率

首免前采集5 組試驗(yàn)牦牛的血液進(jìn)行血清學(xué)免疫抗體檢測，結(jié)果均未檢測出包蟲病陽性抗體；二免后15 d，再次采集5 組試驗(yàn)動物血液進(jìn)行免疫抗體檢測，發(fā)現(xiàn)A、B、C 組牦牛的抗體陽性率分別為30%、40%、50%，與E 組的90%存在顯著性差異（P＜0.05），D 組抗體陽性率為80%，與E 組無顯著性差異（P＞0.05）。具體檢測結(jié)果見表1。

表1 牦牛免疫后血清抗體檢測結(jié)果

2.3 免疫抗體合格率

經(jīng)檢測，E 組有7 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為70%。A 組和B 組牦牛的樣品OD450nm均＜0.6，無抗體合格樣本；C 組有1 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為10%，與E 組差異顯著（P＜0.05）；D 組有4 頭牦牛的樣品OD450nm＞0.6，抗體合格率為40%，與E 組存在顯著性差異（P＜0.05）。具體結(jié)果見表1 和圖1。

3 討論

牦牛養(yǎng)殖是四川省藏族地區(qū)農(nóng)牧民的重要收入來源之一，而四川省牧區(qū)也是包蟲病的重要流行區(qū)，包蟲病流行嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展和農(nóng)牧民收入增長。加快推進(jìn)牦牛包蟲病免疫防控，建立健全畜間防控體制機(jī)制，是解決農(nóng)牧民增收，加快鄉(xiāng)村振興的重要技術(shù)手段。

細(xì)粒棘球絳蟲EG95 重組蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，有效抵抗棘球蚴感染。以EG95 蛋白為基礎(chǔ)研制的基因工程亞單位疫苗在多種動物及不同國家和地區(qū)的臨床試驗(yàn)和田間試驗(yàn)中均表現(xiàn)了良好的預(yù)防效果[5-6]。Heath 等[7-8]進(jìn)行牛（免疫劑量分別為50、250 和500 μg EG95 抗原）和牦牛（免疫劑量為50 μg EG95 抗原）免疫保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在二次免疫（250 μg EG95 抗原）后，免疫保護(hù)率達(dá)90%，并能維持12 個月；在二次免疫12 個月后進(jìn)行三免，保護(hù)率提高到99%。牦牛是生活在高寒高海拔地區(qū)的特殊畜種。陽愛國等[9]試驗(yàn)了包蟲病基因工程EG95 疫苗（免疫劑量分別為250和500 μg EG95 抗原）對牦牛的免疫效果、安全性，并調(diào)查該疫苗在不同性別、不同年齡、不同海拔地區(qū)牦牛間存在的免疫差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組牦牛在免疫抗體產(chǎn)生時間、群體陽性率等方面無顯著差異（P＞0.05），且該疫苗適用于不同海拔地區(qū)牦牛使用，安全性高并可產(chǎn)生較高的抗體水平。

本研究試驗(yàn)了不同劑量（分別含有50、100、150、200、250 μg EG95 抗原）包蟲病基因工程亞單位疫苗EG95 對牦牛的免疫效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)免疫劑量為250 μg 時，抗體合格率顯著高于其他劑量組，群體抗體陽性率和合格率均較為理想。因此，建議對適齡牦牛進(jìn)行二次免疫，每次的免疫劑量為250 μg EG95 抗原，間隔28 d。