新疆北疆部分地區鼠類伯氏疏螺旋體攜帶情況調查

路 暢，劉麗婭，馬曉菁，葉 鋒，谷文喜，努爾巴哈提·努爾旦，易新萍

（1.新疆農業大學動物醫學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆烏魯木齊 830011）

萊姆病（Lyme disease）是由伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）感染引起的一種自然疫源性傳染病，也是以蜱為傳播媒介，野生動物及家畜動物為保菌宿主的人獸共患病[1]，主要經蜱叮咬傳播，可導致人體多系統和器官的損害，嚴重者終生致殘甚至死亡[2-3]。該病于1992 年被世界衛生組織（WHO）列為重點防治的研究對象[4]。伯氏疏螺旋體在自然界的存活依賴于其在媒介與宿主動物間的相互傳播，主要通過硬蜱屬中某些蜱的吸血活動在動物宿主間以及動物宿主和人之間傳播[5]。

伯氏疏螺旋體宿主多、范圍廣，涉及大、中、小型野生哺乳動物以及鳥類、爬行動物、家畜及蜱類，其中作為貯存宿主的嚙齒類動物就有10 余種[6]。嚙齒類動物分布廣、數量多，是伯氏疏螺旋體的主要傳染源，也是伯氏疏螺旋體的重要宿主[7]。為了解新疆地區鼠類萊姆病流行情況，認識萊姆病病原體傳播媒介及其與動物儲存宿主間的關聯性，本研究對新疆北疆部分地區鼠類中的伯氏疏螺旋體攜帶情況及其基因型進行調查，以期為預測新疆地區人萊姆病的潛在流行風險及其防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021 年1—9 月在新疆昌吉州吉木薩爾縣、伊犁哈薩克自治州新源縣、塔城地區烏蘇市巴音溝，采用布籠法采集147 只野生鼠類，在實驗室取其腎臟和膀胱組織樣，凍存于-20 ℃備用。

1.2 DNA 模板制備

將采集的野鼠用75%乙醇浸泡10 min，無菌操作收集腎臟和膀胱，取黃豆大小的組織，置于含300 μL 生理鹽水的2 mL 離心管中；加入2 顆鋼珠，組織研磨4 000 次/min，震蕩20 s 勻漿；沸水浴8 min，12 000 r/min 離心1 min；取上清用作PCR 反應模板，-20 ℃保存備用。標準伯氏疏螺旋體B31 株（ATCC 35210）基因組DNA，使用常規DNA 試劑盒提取。

1.3 實時熒光定量PCR

依據文獻[8] 中的伯氏疏螺旋體16S rRNA 基 因（GenBank N0.NC.018747.1）序列設計引物及探針（上游引物：5'-ACCCTTTACGCCCAATAATCCC-3'；下游引物：5'-AGGAAATGACAAAGTGATGACG-3'；探 針：5'-FAM-AACAACGCTCGCCC-3'-MGB），委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

Real-time PCR 反應體系總體積20.0 μL：2×Super Real PreMix 10.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，FAM-MGB 探針（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O補至20.0 μL。反應程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共45 個循環。結果判定：在陽性對照和陰性對照均成立的前提下，曲線光滑，有明顯指數擴增期，且Ct ≤40 的樣本判為陽性。

1.4 巢式PCR 擴增

以文獻[9]中的伯氏疏螺旋體5S—23S rRNA間隔區序列為參照，設計巢式PCR 引物（表1）。

表1 巢式PCR 引物序列

每輪反應體系：2×UTaqPCR Mix 7.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，補水至15.0 μL。第1 輪程序：94 ℃10 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃終止反應。第2 輪程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，62 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃終止反應。

1.5 測序及序列分析

將基于伯氏疏螺旋體5S—23S 間隔序列的巢式PCR 陽性產物回收純化后送至生物公司測序，將獲得的序列信息通過NCBI 網上BLAST 工具與GenBank 中注冊的基因序列進行比對，確定伯氏疏螺旋體基因型。

1.6 構建系統發育樹

應用MEGA7 軟件構建伯氏疏螺旋體5S—23S間隔序列片段的系統發育樹，分析其進化關系。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR 檢測

應用實時熒光定量PCR 方法，對鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本進行檢測。結果（圖1）顯示：空白對照（H2O）樣本無擴增曲線，伯氏疏螺旋體標準株B31 出現了擴增曲線，Ct 為28.91；147 份鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本中，檢出11 份伯氏疏螺旋體陽性樣本，陽性率為7.48%（11/147）。

2.2 巢式PCR 檢測

應用巢式PCR 檢測147 份鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本，以伯氏疏螺旋體標準株B31 基因組DNA（陽性對照）為參照。結果（表2、圖2）顯示：有13 份樣品擴增出225 bp 大小的目的片段，說明新疆這3 個地區的鼠類中均存在伯氏疏螺旋體攜帶狀況，陽性率為8.84%（13/147）。

表2 鼠類攜帶伯氏疏螺旋體檢測結果

2.3 基因分型鑒定及系統發育樹構建

對13 份巢式PCR 陽性產物進行測序，將測得的序列在NCBI 上進行BLAST 比對分析。結果顯示：有6 份樣品未測出有效序列，其中3 份為假陽性，3 份出現重疊峰，可能存在多種基因型混合感染；7 份樣本獲得有效產物序列（YL1、JMSE1、WS1—WS5），分屬于3 種伯氏疏螺旋體基因型，其中編號YL1（伊犁）、JMSE1（吉木薩爾）、WS2（烏蘇）3 份樣本為Borreliella garinii基因型，WS1（烏蘇）為Borreliella bavariensis基因型，WS3—WS5（烏蘇）不能明確基因型。

將7 份樣本序列采用NJ 算法（Bootstrap 為1 000）構建系統發育樹。從構建的伯氏疏螺旋體系統發育樹（圖3）可以看出，新疆地區鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體主要分屬于2 個大分支，其中4 株伯氏疏螺旋體（YL1、JMSE1、WS1、WS2）聚集在其中一個大分支上，包含B.garinii基因型和B.bavariensis基因型，其余3 株（WS3—WS5）聚集于另一個大分支，與B.garinii基因型進化關系接近。

3 討論

近年來，萊姆病在國內的發病區域和發病率分別呈迅速擴大和上升趨勢，對國民健康有著較大影響[10]。新疆地處歐亞大陸腹地，四周高山環繞，地域遼闊，地理地貌和氣候環境復雜多樣，因而孕育了多樣的植被類型和野生動物群，同時也為自然疫源地的形成和發展提供了有利條件。新疆地區的萊姆病病原學和人畜血清流行病學調查研究證實了新疆多個地區為萊姆病自然疫源地[11-13]。

本調查于2021 年1—9 月在新疆3 個地區（昌吉州吉木薩爾縣、伊犁哈薩克自治州新源縣、烏蘇市巴音溝）采集鼠類147 只，分別用巢式PCR 和實時熒光定量PCR 兩種方法檢測鼠類攜帶伯氏疏螺旋體陽性率。實時熒光定量PCR 方法檢出的新疆地區鼠類伯氏疏螺旋體陽性率為7.48%（11/147），巢式PCR 方法為8.84%（13/147）。兩種方法檢測的鼠類伯氏疏螺旋體陽性率差異無統計學意義（χ2=0.369，P＞0.05）。兩種方法所用的基因不同，因此同時采用兩種方法可以提高伯氏疏螺旋體檢測結果的準確性、全面性，若要進行基因分型鑒定，則以巢式PCR 方法檢測結果為準。

研究[14]表明，目前世界范圍內的伯氏疏螺旋體至少有20 種基因型，其中5 種基因型具有致病性。我國常見的有B.garinii、B.afzelii、B.burgdorferi sensu stricto3 種致病基因型[15]。我國北方以B.garinii基因型為主[16]，南方以B.burgdorferi sensu stricto基因型為主[17]。本調查發現，鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體B.garinii基因型占42.9%，B.bavariensis基因型占14.3%。而B.bavariensis基因型為B.garinii基因型的亞種，在歐洲和亞洲廣泛存在，主要以嚙齒類動物為儲存宿主[18]，目前國內還未見該基因型的相關報道。B.garinii基因型主要與神經系統癥狀有關，可引起人類精神異常，對人群危害嚴重[19]。

將7 條伯氏疏螺旋體與GenBank 中已公開發表的7 條不同基因型序列，應用MEGA7 軟件構建伯氏疏螺旋體5S—23S 間隔序列片段系統發育樹。從該系統發育樹可以看出，新疆地區鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體主要分屬于2 個大分支，其中4條序列聚集在一個大分支上，包含B.garinii基因型和B.bavariensis基因型，與來自西伯利亞B.bavariensis和我國臺灣B.garinii基因型進化關系接近；其余3 條聚集于B.burgdorferi另一個大分支上，與我國東北B.garinii mgds分離株遺傳進化關系接近，但也有差別。這提示新疆地區伯氏疏螺旋體具有豐富的遺傳多樣性。聚集在B.garinii mgds這一分支上的B.burgdorferi基因型是否為我國或新疆特有的獨立基因型還有待進一步分析。