新疆石河子市牛源大腸桿菌分離鑒定及對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性分析

許淑蕓，何白雪，俞 杰，馬 雪，胡曉彥，鄒思穎，李 劼，周 霞，黃 新，鐘發(fā)剛，吳桐中，韓猛立，張星星

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000）

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是一種重要的人獸共患食源性病原菌[1]。新疆是我國(guó)重要的養(yǎng)牛地區(qū)，牛飼養(yǎng)量逐年增加，牛大腸桿菌病時(shí)有發(fā)生[2]。大腸桿菌在規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)可引起犢牛腹瀉、出血性腸炎、肺炎、腦炎以及敗血癥等病癥，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)大腸桿菌也是組成人和動(dòng)物消化道正常菌群的重要細(xì)菌，在維持機(jī)體生態(tài)平衡和健康狀態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究[3-4]顯示，來(lái)自健康動(dòng)物的大腸桿菌也表現(xiàn)出越來(lái)越明顯的耐藥特性。而腸道是大腸桿菌的最大貯存庫(kù)，其耐藥性可以通過(guò)食物鏈和直接接觸傳遞，因此給公共衛(wèi)生帶來(lái)了一定的潛在威脅。McGowan 等[5]證實(shí)，存在于少數(shù)細(xì)菌中的碳青霉烯酶已經(jīng)在一些重要的腸道菌群中被發(fā)現(xiàn)。

目前獸醫(yī)臨床控制或治療細(xì)菌性病原引起的感染主要使用抗生素。而抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致致病性大腸桿菌多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使大腸桿菌病防治效果明顯降低。研究[6]表明，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是牛場(chǎng)常用的一類(lèi)藥物，而耐藥細(xì)菌主要通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺水解酶來(lái)抑制β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥活性。顧曉曉等[7]研究報(bào)道，新疆部分地區(qū)牛、羊致病性大腸桿菌對(duì)頭孢唑林、阿莫西林等藥物具有一定耐藥性。目前，研究石河子市牛源正常菌群大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥表型和相關(guān)耐藥基因攜帶情況的報(bào)道較少。因此，本研究在分離鑒定健康牛腸道正常大腸桿菌基礎(chǔ)上，分析分離株對(duì)部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥表型和相關(guān)耐藥基因攜帶情況，以期為牛源致病性大腸桿菌耐藥機(jī)制的深入研究以及石河子市減抗政策的加速實(shí)施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便來(lái)源 無(wú)菌采集新疆石河子市規(guī)模化牛場(chǎng)健康牛糞便樣本。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 2×TaqDNA 聚合酶、2×PCR Buffer、2×dNTP、LB 培養(yǎng)基、DL 2 000 DNA Marker 等，均為T(mén)aKaRa 公司產(chǎn)品；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1，8-13]，設(shè)計(jì)大腸桿菌通用引物16S rRNA，分子分型arpA、chuA、yjaA及TspE4.C2基因引物，β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因CTX-M、OXA、TEM及SHV引物。引物均由華大基因有限公司制備合成。相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌相關(guān)基因引物信息

1.1.4 藥敏紙片種類(lèi)及規(guī)格 β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物藥敏紙片種類(lèi)及規(guī)格：頭孢唑林（Cefazolin）30 μg、阿莫西林（Amoxicillin）20 μg、頭孢拉定（Cefradine）30 μg、青霉素（Penicillin）10 U、頭孢噻肟（Cefotaxime）30 μg、頭孢西丁（Cefoxitin）30 μg、頭孢噻吩（Cephalothin）30 μg、氨芐西林（Ampicillin）10 μg、頭孢氨芐（Cephalexin）30 μg、頭孢吡肟（Cefepime）30 μg。藥敏紙片均由杭州微生物試劑有限公司合成制備。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 將無(wú)菌采集的樣本稀釋涂布于LB 培養(yǎng)基上，放置于恒溫箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；將符合要求的疑似菌接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行純化，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h；選取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的特征性菌落進(jìn)行涂片，革蘭染色鏡檢。選取疑似菌進(jìn)行生化鑒定，包括葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、IMViC（靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙二酰試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)）。

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA 序列分析 以提取的分離菌基因組DNA 為模板，采用PCR 方法擴(kuò)增16S rRNA 序列，PCR 反應(yīng)均在20 μL 體系中進(jìn)行。PCR 總體系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取6 μL 擴(kuò)增后產(chǎn)物，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析結(jié)果。

1.2.3 分離株系統(tǒng)進(jìn)化分群 參考Clermont[13]判定標(biāo)準(zhǔn)，采用多重PCR 方法進(jìn)行系統(tǒng)分群。PCR反應(yīng)均在50 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行。PCR 體系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

1.2.4 細(xì)菌耐藥基因PCR 檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-12]合成耐藥基因，包括CTX-M、OXA、TEM、SHV。引物信息見(jiàn)表1。在提取分離菌DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為40 μL。總體系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

1.2.5 耐藥表型檢測(cè) 參照CLSI 于2012 年制定的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)（K-B 法）[14]，將分離菌菌液濃度調(diào)節(jié)至0.5 麥?zhǔn)媳葷岫龋?00 μL 均勻涂布在LB 平板上，靜置5 min，待菌液不流動(dòng)后，使用鑷子將藥敏紙片貼于平板上，紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平板邊緣不少于15 mm。將平板倒置于恒溫箱內(nèi)37 ℃，培養(yǎng)16 h，檢測(cè)分離菌對(duì)10 種抗生素的耐藥表型。根據(jù)抑菌圈大小判斷分離細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

分離株在LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出白色、圓潤(rùn)、表面略凸、邊緣光滑的小菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出紅色、圓潤(rùn)、表面微凸、邊緣光滑的菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出黑色、光滑、表面微凸、邊緣光滑帶金屬光澤的小菌落（圖1）。鏡檢結(jié)果顯示：分離菌株為革蘭染色紅色陰性、兩端鈍圓的短小桿菌，與大腸桿菌特點(diǎn)一致。

經(jīng)16S rRNA 基因序列PCR 擴(kuò)增、電泳，最終擴(kuò)增出大小約100 bp 目的基因條帶（圖2）。測(cè)序結(jié)果（圖3）顯示，分離株與GenBank 中相應(yīng)基因序列同源性在99%以上。結(jié)合生化反應(yīng)與16S rRNA 基因序列分析結(jié)果，確定分離菌株為大腸桿菌。

2.2 分離株系統(tǒng)進(jìn)化分群

采用Clermont 的四重PCR 擴(kuò)增方法，進(jìn)行arpA、chuA、yjaA和TspE4.C2目的基因擴(kuò)增、電泳。結(jié)果顯示：100 株大腸桿菌中，38 株屬于A 群大腸桿菌，53 株屬于B1群大腸桿菌，7 株屬于C 群大腸桿菌，2 株屬于F 群大腸桿菌。部分分型結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3 細(xì)菌耐藥基因PCR 檢測(cè)

對(duì)100 株大腸桿菌進(jìn)行blaCTX-M、blaOXA、blaTEM和blaSHV耐藥基因PCR 擴(kuò)增，結(jié)果在5 株分離菌中檢測(cè)到blaSHV基因，1 株中檢測(cè)到blaCTX-M基因，未檢測(cè)到blaOXA和blaTEM基因片段。部分結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

分離菌株對(duì)頭孢唑林的耐藥性最高，對(duì)頭孢吡肟的敏感性最高（表2）。抗1 種藥物的有16株，占16%；抗2 種藥物的有32 株，占32%；抗3 種藥物的有21 株，占21%；抗4 種藥物的有10株，占10%；抗5 種藥物的有10 株，占10%；抗6 種藥物的有1 株，占1%。耐藥菌株占總菌株數(shù)的90%。各分群的耐藥表型測(cè)定結(jié)果（表3）顯示：A 群大腸桿菌對(duì)頭孢唑林、阿莫西林、頭孢拉定耐藥率分別為57.89%、50.00%、47.37%，B1群大腸桿菌對(duì)頭孢唑林、頭孢拉定、阿莫西林、青霉素耐藥率分別為77.36%、52.83%、50.94%、33.96%，C 群大腸桿菌對(duì)阿莫西林、頭孢唑林耐藥率分別為71.43%、57.14%，F(xiàn) 群大腸桿菌對(duì)頭孢唑林、青霉素、頭孢拉定耐藥率均為100%。

表2 100 株牛源大腸桿菌對(duì)10 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥表型測(cè)定結(jié)果

表3 分離菌各分群對(duì)10 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥表型測(cè)定結(jié)果

3 討論

16S rRNA 基因存在于所有生物的染色體基因組中，具有高度保守性，因此在細(xì)菌分離鑒定時(shí)，除了用常規(guī)生化反應(yīng)鑒定外，結(jié)合16S rRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，能更準(zhǔn)確完成細(xì)菌鑒定[15]。根據(jù)毒力基因建立的系統(tǒng)發(fā)育群系，將大腸桿菌分為7 個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，即A、B1、B2、C、D、E 和F，其中強(qiáng)毒性腸外菌株主要屬于B2群，也有部分屬于D群，而大多數(shù)共生菌株屬于A 群[16]。本研究中的100 株分離菌與Clermont 分型結(jié)果基本一致。

致病性大腸桿菌感染的控制與治療主要依靠抗生素，因而導(dǎo)致不同來(lái)源致病性大腸桿菌對(duì)不同抗生素表現(xiàn)廣泛的耐藥性。而動(dòng)物腸道中存在的正常菌群大腸桿菌，也對(duì)不同抗菌藥物逐漸表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，這給動(dòng)物本身和人類(lèi)生物安全帶來(lái)了潛在威脅[17]。本研究中，來(lái)自牛腸道正常菌群大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)部分抗菌藥的耐藥率雖然低于顧曉曉等[7]報(bào)道的新疆部分地區(qū)牛、羊致病性大腸桿菌對(duì)相應(yīng)抗生素的耐藥率，但對(duì)頭孢唑林、阿莫西林的耐藥率分別達(dá)到69%和52%，與張濟(jì)培等[10]、韋慶蘭等[18]對(duì)水禽源大腸桿菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似。本研究中，A 群分離菌對(duì)頭孢唑林、阿莫西林、頭孢拉定的耐藥率較高，B1群分離菌對(duì)頭孢唑林、頭孢拉定、阿莫西林、青霉素的耐藥率較高，C 群分離菌對(duì)阿莫西林、頭孢唑林的耐藥率相對(duì)較高，F(xiàn) 群分離菌對(duì)頭孢唑林、青霉素、頭孢拉定的耐藥菌株占比均為100%，表明正常腸道大腸桿菌對(duì)青霉素類(lèi)抗生素以及部分一代頭孢菌素類(lèi)藥物具有較高的耐藥性，而耐藥性和菌株Clermont 分型無(wú)明顯關(guān)系。

研究[19]表明，blaSHV主要與青霉素類(lèi)抗生素如阿莫西林耐藥基因相關(guān)，blaCTX-M與頭孢噻吩等抗生素耐藥基因相關(guān)，blaOXA與三代頭孢菌素類(lèi)抗生素如頭孢西丁耐藥基因相關(guān)，blaTEM與氨芐西林、青霉素及頭孢噻吩類(lèi)抗生素耐藥基因相關(guān)。冀亞路等[20]對(duì)吉林省規(guī)模化豬場(chǎng)斷奶仔豬進(jìn)行大腸桿菌耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)，blaTEM和blaCTX檢測(cè)率分別為30.8%和15.4%，而blaSHV檢測(cè)率為0；表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)青霉素耐藥率為99.8%，阿莫西林為81.6%，氨芐西林為100%。王蕾等[21]在烏蒙地區(qū)進(jìn)行威寧黃牛糞源大腸桿菌研究發(fā)現(xiàn)，blaTEM和blaSHV檢出率分別為24%和19%，對(duì)青霉素耐藥率只有13%。本研究的100 株分離菌株中，有1 株檢測(cè)到blaCTX-M基因，5 株檢測(cè)到blaSHV基因，均未檢測(cè)到blaOXA和blaTEM基因。本研究結(jié)果與其他動(dòng)物糞源大腸桿菌攜帶耐藥基因情況存在明顯差異，推測(cè)不同地區(qū)、不同來(lái)源大腸桿菌可能與地區(qū)用藥、菌群差異以及耐藥基因的傳遞方式有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，耐藥表型與耐藥基因檢出率也有不一致現(xiàn)象，如blaSHV基因檢出率最高，而阿莫西林在耐藥表型檢測(cè)中的耐藥率超過(guò)了50%，青霉素僅為26%，其中是否存在其他未檢/未發(fā)現(xiàn)的耐藥基因或其他機(jī)制介導(dǎo)的耐藥，還需要進(jìn)一步研究。牛正常腸道菌群細(xì)菌耐藥性普遍增強(qiáng)的現(xiàn)象提示，應(yīng)加快減抗政策的實(shí)施。