可溶性程序性死亡受體-1和干擾素調節因子4在類風濕關節炎患者血清中的表達與疾病活動性、免疫炎癥的關系

黃艷艷, 林書典, 詹 鋒, 肖 璐, 詹宇威, 莫碧瑤, 韓葉光

(海南省人民醫院/海南醫學院附屬海南醫院, 1. 風濕免疫科, 2. 檢驗科, 海南 海口, 570311)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病，主要侵犯機體的手足關節。RA以T細胞浸潤滑膜、持續的炎性反應、進行性軟骨退化及骨侵蝕為主要病理改變，可導致患者關節畸形和功能障礙，甚至增大心血管事件風險，嚴重影響生活質量[1-2]。RA病因復雜，至今發病機制仍不明確，且臨床上僅能對癥治療，大部分患者無法徹底治愈[3]。因此，進一步闡明RA發病機制，尋找新的有效治療靶點，仍是臨床研究者迫切需要解決的問題。可溶性程序性死亡受體-1(sPD-1)是程序性死亡受體-1(PD-1)的可溶形式，可阻斷PD-1/程序性死亡配體-1(PD-L1)負性信號，促進T細胞的活化增殖，強化免疫應答，刺激炎癥因子分泌，在自身免疫性疾病中發揮重要作用[4-5]。干擾素調節因子4(IRF4)是誘導、調節干擾素的轉錄因子，在T細胞分化成熟調節中發揮不可或缺的作用，參與多種自身免疫性疾病的發病環節[6-7]。sPD-1、IRF4均參與了RA的發生，但其與RA疾病活動性、免疫炎癥的關系尚不明確[8-9]。本研究檢測不同受試者血清中sPD-1、IRF4表達水平，初步探討sPD-1、IRF4與RA患者疾病活動性及體內炎癥反應的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月—2021年9月接受治療的RA患者100例(RA組)為研究對象，其中緩解期患者(RA緩解組)50例，活動期患者(RA活動組)50例。納入標準: RA診斷依據《2018年中國類風濕關節炎診療指南》[10], 依據28個關節疾病活動度(DAS28)評分[11]對患者RA疾病活動性進行分組，緩解期為DAS28評分<2.8分，活動期為DAS28評分≥2.8分。排除標準: ① 感染、外傷等因素導致的關節腫痛者; ② 合并惡性腫瘤、糖尿病、血液系統疾病、重要臟器功能不全、其他自身免疫性疾病及風濕性疾病者; ③ 依從性差者; ④ 年齡<18歲者。選取同期接受治療的骨關節炎(OA)患者50例為OA組，排除有過敏史、自身免疫性疾病史者，選擇同期進行體檢的健康者50例為對照組。收集所有入選者性別、年齡、體質量指數(BMI)等一般資料。所有入選者對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究得到醫院倫理委員會批準(批號202008-22)。

1.2 試劑與儀器

人sPD-1、白細胞介素-17(IL-17)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(貨號CD-102163、CD-100414)購自武漢純度生物科技有限公司; 人IRF4 ELISA試劑盒(貨號EH9468)購于武漢菲恩生物科技有限公司; 人白細胞介素-4(IL-4)、干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒(貨號SEKH-0011、SEKH-0046)購于北京索萊寶科技有限公司。MODEL550酶標儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 ELISA法檢測受試者血清sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ表達水平

RA患者、OA患者入院第2天，健康者體檢當天均抽取清晨空腹靜脈血5 mL, 3 000轉/min、4 ℃離心處理10 min, 結束后取上清液，分裝后置于-80 ℃冰箱保存待測。血清樣本于冰上融化，采用人sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ ELISA試劑盒進行檢測，在酶標儀上測得光密度(OD)值，繪制標準曲線，計算血清sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ表達水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 對照組、OA組和RA組受試者一般資料比較

對照組、OA組和RA組受試者性別、年齡、BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性，見表1。

表1 對照組、OA組和RA組受試者一般資料比較

2.2 對照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較

對照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較, OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與OA組比較, RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較 ng/mL

2.3 RA緩解組和RA活動組RA患者血清sPD-1、IRF4水平比較

與RA緩解組比較, RA活動組RA患者血清sPD-1、IRF4水平升高，差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 RA緩解組和RA活動組患者血清sPD-1、IRF4水平比較 ng/mL

2.4 對照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較

對照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較, OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與OA組比較, RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平升高，差異有統計學意義(P<0.05), 見表4。

表4 對照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較 pg/mL

2.5 RA患者血清sPD-1、IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平的相關性分析

相關性分析結果顯示, RA患者血清sPD-1水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關(r=0.432、0.426、0.515,P<0.05), RA患者血清IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關(r=0.480、0.536、0.526,P<0.05), 見圖1。

圖1 RA患者血清sPD-1、IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平的相關性分析圖

3 討 論

RA是一種以滑膜炎癥及關節軟骨、骨質侵蝕性破壞為主要特征的自身免疫性疾病，會引起患者關節疼痛、腫脹、僵硬和功能喪失[12]。RA作為特發性的自身免疫性、慢性炎癥疾病，自身免疫紊亂及炎癥反應異常在其發病機制中扮演重要角色[1]。T細胞異常活化介導的免疫系統紊亂在RA進展中起關鍵作用, T細胞異常激活后，會分泌IL-4、IL-17、IFN-γ等各種炎癥細胞因子，加重RA滑膜炎病情。本研究顯示, RA患者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均高于OA患者、健康者，表明T細胞活化分泌IL-4、IL-17、IFN-γ參與RA發生。研究[13]發現，T細胞活化過程需要抗原刺激提供的第一信號和協同刺激分子提供的第二信號刺激，如果缺失協同刺激分子的相互作用傳遞，會導致T細胞無反應性或功能失活。因此，對T細胞增殖活化有關的因子展開研究有助于闡明RA發病機制，找到新的有效治療靶點。

在免疫調節中, PD-1/PD-L1信號通路發揮著負性調節作用, PD-1可結合PD-L1抑制正性共刺激分子的表達，從而阻止T細胞的異常活化、增殖，減少IL-4、IL-17、IFN-γ等炎癥因子的分泌[14]。武加標等[15]研究表明, PD-1/PD-L1信號通路可通過調控T細胞參與RA的發生，而sPD-1作為PD-1的可溶性型形式，具有阻斷PD-1/PD-L1負性信號通路的生物學功能，可能調控IL-4、IL-17、IFN-γ的分泌。郭艷華等[16]發現, sPD-1在RA患者血清中呈異常高表達，并與病情嚴重程度呈正相關。本研究發現, RA患者血清sPD-1水平較OA患者、健康者高，活動期RA患者血清sPD-1水平較緩解期RA患者高，表明sPD-1不僅參與RA的發病過程，還與RA病情進展有關。此外, RA患者血清sPD-1水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關，表明sPD-1表達與T細胞活化分泌IL-4、IL-17、IFN-γ關系密切，推測sPD-1可能通過阻斷PD-1/PD-L1通路導致RA患者T細胞活化信號不斷增強，最終導致自身免疫紊亂，并不斷分泌IL-4、IL-17、IFN-γ等細胞因子，加重RA病情。

在T細胞主導的免疫反應中, IRF家族成員IRF4可作為非特異的轉錄因子參與調節Treg/Th17、Th1/Th2細胞的分化和發育，進而影響IL-4、IL-17、IFN-γ等細胞因子的分泌過程[17]。郭釗林[18]研究顯示, IRF4在自身免疫性疾病系統性紅斑狼瘡患者血清中顯著增高，且與疾病活動性指數相關。本研究顯示, RA患者血清IRF4水平較OA患者、健康者均升高，且活動期RA患者血清IRF4水平較緩解期RA患者升高，表明IRF4參與了RA的發生，并與RA疾病活動性有關。相關性分析表明, RA患者血清IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平呈正相關，表明IRF4與免疫炎癥反應關系密切，鑒于IRF4與T細胞主導的免疫反應的關系，推測IRF4可能增強了RA患者的T細胞活化信號，刺激其不斷向Treg/Th17、Th1/Th2分化，進而引起IL-4、IL-17、IFN-γ分泌的增加，導致免疫炎癥反應異常，從而參與RA的發生和發展。

綜上所述，sPD-1、IRF4在RA患者血清中均顯著升高，在不同疾病活動性RA患者血清中呈差異表達，與患者體內免疫炎癥反應異常密切相關，參與RA的發生和發展，有潛力成為RA的有效治療靶點。