新型冠狀病毒檢測技術的研究進展

王子豪, 黃 瑤, 2, 孔桂美

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225000; 2. 江蘇省揚州市疾病預防控制中心, 江蘇 揚州, 225000)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的迅速傳播導致了新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球范圍內的大流行。因此，開發快速而高特異性的病毒檢測方法以便快速識別和隔離感染患者對控制SARS-CoV-2的傳播至關重要，是全球疫情防控的關鍵。目前，檢測SARS-CoV-2感染的方法包括病原學檢測、核酸檢測和血清學檢測。核酸檢測，尤其是實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測方法具有諸多優勢，是目前檢測SARS-CoV-2感染的首選方法。血清學檢測方法主要針對血液中病毒的特異性抗體進行檢測，與核酸檢測有著較好的互補性。本研究對目前SARS-CoV-2檢測方法的研究進展進行綜述，以期為臨床醫生及科研工作者提供參考。

1 病原學檢測

病原學檢測是直接檢測機體內病毒感染情況的方法，是檢測SARS-CoV-2的金標準。病毒的分離、培養、鑒定及電鏡觀察是目前主要使用的病原學檢測方法。LIU C等[1]使用冷凍電子顯微鏡首次觀察到了SARS-CoV-2經滅活后的真實形貌，病毒顆粒近似球形或中度多形性，刺突向外呈釘子狀，病毒體嵌入包膜內; 同時，對融合后尖峰結構的研究則表明了融合后的刺突是柔性的，并且相對于病毒膜具有有限的可變方向。非常關鍵的收獲是捕捉到了病毒即將與細胞發生融合這一重要的中間狀態，這為SARS-CoV-2的識別、鑒定和臨床相關研究提供了重要的超微影像基礎。ZHU N等[2]從3份支氣管肺泡灌洗樣本中分離獲得病毒毒株; 同時，體外培養表明接種人氣道上皮細胞96 h后即可觀察到細胞病變作用，直到接種后6 d, 在Vero E6和Huh-7細胞系中仍未觀察到特異性的細胞病變作用。雖然病原學檢測方法是檢測SARS-CoV-2的金標準，但與其他檢測技術相比，其對實驗室環境要求極為苛刻，必須在P3級及以上的實驗室內進行，同時操作過程繁瑣、耗時且難度高，難以滿足現階段SARS-CoV-2的檢測需求，只適用于基礎科學研究。

2 核酸檢測

機體感染SARS-CoV-2后會產生大量RNA, 而免疫系統產生的抗體往往出現較晚，因此核酸檢測仍是目前最主要的檢測方法。核酸檢測的主要樣本來源包括感染者的鼻咽拭子、深部痰、下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液等。

2.1 基因測序技術

隨著高通量測序技術(NGS)的迅猛發展，其在病原檢測中展現出一定的技術優勢，可在第一時間獲取新發未知病毒的基因組序列信息，為突發疫情的防控和后續研究提供了技術支撐。NGS可一次性地檢測包括SARS-CoV-2在內的所有可能感染的病原微生物基因序列[3], 為獲得多重感染或繼發感染的相關病原信息提供支持。CHEN L J等[4]利用宏基因組測序(mNGS)快速檢測出患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本中的SARS-CoV-2; 進一步的系統發育分析表明, SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒毒株bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21具有87.9%的核苷酸同源性。WANG M等[5]結合病毒靶向擴增和納米孔測序長讀、實時的優勢，創造性地開發了納米孔靶向測序(NTS)技術，僅需6～10 h即可同時檢測包括SARS-CoV-2等多種常見的呼吸道病毒，有助于快速判斷SARS-CoV-2患者是否發生多重感染，對臨床診斷及治療具有重大的意義。同時, NTS還可以檢測病毒突變，用于SARS-CoV-2的分型，為流行病學分析提供支持。雖然NGS具有高準確性、高靈敏度等優勢，但鑒于其檢測儀器昂貴、檢測結果需要專業人士來解讀、檢測周期長等問題，難以進行大規模的快速篩查。

2.2 qRT-PCR技術

qRT-PCR技術是目前臨床檢測SARS-CoV-2的主要手段。qRT-PCR技術是從樣本中分離出病毒RNA, 利用熒光信號對逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的進程進行實時檢測，最后通過標準曲線進行定量分析。目前, SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因是qRT-PCR的主要靶向。CHU D K W等[6]開發了2種單步qRT-PCR, 用于檢測SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因，通過對COVID-19患者的臨床樣本進行進一步系統性研究，證實了該方法在臨床診斷中的價值，并發現了N基因RT-PCR檢測對臨床樣本中的SARS-CoV-2 RNA更為敏感，約是ORF1ab基因測定的10倍。依據檢測性能,N基因RT-PCR被建議用作篩查測定，而ORF1ab基因測定則推薦作為確診測定。CORMAN V M等[7]在缺乏SARS-CoV-2分離株的條件下，利用公開的SARS-CoV-2序列，開發了一種針對N、E和RdRP基因的單步RT-PCR試劑盒，其中RdRP基因測定表現出最高的靈敏度。CHAN J F W等[8]開發了針對RdRp/Hel不同區域的新型檢測方法，對于不同類型的臨床樣本均顯示出較之前開發的RdRp-P2基因測定法更高的靈敏度。更重要的是,RdRp/Hel檢測方法與其他常見呼吸道病原體無交叉反應，具有高度特異度。

盡管qRT-PCR技術具有成本較低、操作簡便、快速、高靈敏度和高特異度等特點，但仍有缺點，例如采樣方式的不規范以及感染早期時病毒載量低于qRT-PCR檢測閾值等均會導致假陰性結果，因而在后續的檢測工作中需規范樣本采集，多部位聯合采集，以減少假陰性結果的發生[9]。

2.3 微流控芯片技術

微流體技術將樣品制備、反應、分離和檢測等基本操作單元集成到微米級芯片中，自動完成整個分析過程。即時檢驗(POCT)也稱為快速現場檢驗或床頭檢驗，不同于傳統的檢驗模式, POCT是一種在采樣現場立即進行分析的新方法，不需要在實驗室測試中對標本進行復雜的處理程序，可以快速獲得檢驗結果。微流體技術具有低成本、高通量、快速、易于微型化等優勢，被廣泛應用于POCT領域。DVBOX(DetectVirus BOX)也稱為檢毒BOX, 是由中國自主研發的一款全封閉、超高靈敏度的一體式微流控SARS-CoV-2核酸檢測POCT設備[10], 具有低實驗操作環境要求、高靈敏度、低假陰性率、低檢測成本、無需運輸樣本、檢測時間短、不需要大量經專業防護和實驗操作培訓的技術人員等優勢。

2.4 環介導等溫擴增技術

RT-PCR因其高靈敏度、高準確度等優勢而被廣泛用于SARS-CoV-2的檢測，但仍然存在一定的局限，例如對溫控精度高的熱循環儀的依賴而導致檢測時間較長，因而無法實時快速地檢測SARS-CoV-2。環介導等溫擴增技術(LAMP)可在等溫條件下快速、高效地擴增，非常適合SARS-CoV-2核酸的現場快速檢測。LAMP是一種新型的核酸擴增方法，在引物和鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下, 60～65 ℃恒溫擴增, 15～60 min即可實現109～1010倍的核酸擴增，一般針對靶基因的6個區域設計4～6種特異引物以提高特異性，具有操作簡便、特異性強、產物易檢測等優點，可廣泛用于感染性疾病的檢測。

HONG T C T等[11]基于LAMP技術開發了一種單步單管加速實時定量RT-LAMP測定法，對臨床49份標本檢測, RT-LAMP分析的檢測靈敏度是RT-PCR的100倍，檢測極限為0.01 PFU。ANAHTAR M N等[12]利用RT-LAMP對135例鼻咽標本進行了COVID-19感染評估，通過優化樣本, RT-LAMP可利用有限的設備實現快速且準確的SARS-CoV-2檢測，有成為理想檢測方法的潛力，尤其是在資源有限的環境下。LAMB L E等[13]確定了RT-LAMP的最佳條件: 63 ℃溫育30 min。YU L等[14]基于LAMP技術進行優化，開發了iLACO快速檢測技術，該技術以ORF1ab基因為檢測靶區進行LAMP等溫擴增，靈敏度與基于Taq酶的RT-PCR相當，同時可以利用測序比對區分SARS-CoV-2與其他病毒，確保了檢測的特異性。

RT-LAMP具有操作簡單、快速高效、檢測靈敏、特異性高等優勢，可用于快速篩查，但極易污染而產生假陽性結果，故要特別注意嚴謹操作。此外, RT-LAMP目前使用的引物組的靈敏度不足以充分檢測出低病毒載量人群的感染[10]。RT-LAMP技術若在產物的回收鑒定、克隆、單鏈分離等方面加以完善和改進，對檢測性能的提高有著積極的意義[15]。

3 血清學檢測

目前, RT-PCR檢測陽性是公認的診斷臨床疑似病例的確診標準。然而, RT-PCR檢測結果的準確性很大程度上依賴于病毒載量，低病毒載量易出現假陰性結果。血清學檢測操作便捷、耗時少，可以作為核酸檢測的有益補充，輔助臨床診斷[16]。同時，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[17]明確將SARS-CoV-2特異性抗體檢測納入確診病例的診斷標準以及疑似病例的排除標準。感染SARS-CoV-2后，免疫球蛋白M(IgM)最早可在感染后的第3天被檢測到，其峰值出現在感染后2～3周; 免疫球蛋白G(IgG)最早可在4 d內出現，并在17 d內達到峰值[18]。血清學檢測方法主要包括膠體金法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和化學發光免疫分析(CLIA), 具有靈敏度高、簡便、范圍廣、易推廣等優點。

3.1 膠體金法

膠體金法是一種以膠體金作為示蹤標志物檢驗抗原抗體的免疫標記檢測技術，無需專業、昂貴的設備和試劑，具有操作簡單、結果迅速等優點，被廣泛應用于病原體檢測領域。

鄧杰倫等[19]對76例患者血清IgM和總抗體進行了膠體金檢測，特異性均>90%, 陽性預測值和陰性預測值均>70%, 可以滿足臨床要求，輔助臨床診斷。LI Z T等[20]基于免疫膠體金技術的原理，創新地研發了IgM-IgG聯合抗體快速檢測方法，可以在15 min內確認近期是否有SARS-CoV-2感染。彭孝斌等[21]分別采用ELISA與膠體金法對26例確診病例和54例發熱患者進行IgM及IgG檢測，結果表明，在現有的試劑條件下，膠體金法較ELISA操作更為簡便、快捷，更適合基層實驗室。

膠體金法多以靜脈血和指尖血為檢測樣本，易于獲取，短時間內即可得到檢測結果，因而適用于大規模人群篩查。但由于較低的靈敏度和較長的檢測窗口期，膠體金法尚不能作為SARS-CoV-2確診和排除的唯一依據[20]。

3.2 CLIA

CLIA是一種具有化學發光測定技術的高靈敏度與免疫反應的高特異度新型檢測分析技術，其原理是以磁微粒作為固相載體，通過對化學發光強度的檢測來確定待測物濃度。CLIA的主要優勢有: ① 樣本易于獲得; ② 具有快速高效，靈敏度高，可實現對樣本全自動、高通量檢測等優勢。但是, CLIA也存在一系列問題，如抗體檢測窗口期長、假陽性率高等。

重慶醫科大學聯合博奧賽斯生物科技有限公司研發的SARS-CoV-2化學發光免疫檢測試劑盒是全球首批獲批的磁微粒化學發光SARS-CoV-2 IgG/IgM檢測試劑盒，已累計完成13 532例樣本測試，其中1 362例為COVID-19確診病例，結果顯示IgM靈敏性為93.7%, 特異性為99.4%, IgG靈敏性為89.6%, 特異性為99.2%。廖凡路等[22]發現部分確診患者SARS-CoV-2核酸檢測始終為陰性，而SARS-CoV-2抗體的檢測，尤其是總抗體對其敏感性很高(總抗體檢測陽性率為100%), 表明增加SARS-CoV-2抗體的檢測對于臨床確診患者的診斷有十分重要的意義。數據分析[23]表明，化學發光抗體檢測試劑仍不能取代RT-PCR確診檢測，且需要專業的化學發光檢測設備，也不適用于人群篩查。

3.3 ELISA

ELISA是目前最常用的免疫分析方法，其原理是利用抗原、抗體間專一性鍵結合的特性進行檢測。由于結合于聚苯乙烯載體上的SARS-CoV-2抗原仍具有免疫活性，配合酶促呈色反應，即可顯示人血清中是否存在SARS-CoV-2抗體，并可根據呈色的深淺進行定量分析。

胡燕等[24]利用ELISA分別對116例COVID-19患者和346例非COVID-19者的血清SARS-CoV-2抗體進行檢測, ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感性為63.79%, 特異性為96.53%, 準確性為88.31%; ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgM抗體的敏感性為58.62%, 特異性為97.40%, 準確性為87.66%, 可以滿足實驗室檢測需要。

ELISA的靈敏度高、特異度高、檢測成本低，但是操作較為繁瑣，在抗體檢測的窗口期以及感染初期難以獲得準確的檢測結果，使得ELISA只能作為SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測手段。

4 總結與展望

目前，核酸檢測仍是SARS-CoV-2主流的早期檢測手段，對SARS-CoV-2的傳播起著重要的預防作用。但是，目前的核酸檢測方法也存在一些局限性，包括檢測靈敏度低、檢測時間長、對實驗環境和人員要求高、在臨床應用中容易出現假陰性結果等。相比較而言，血清學檢測操作便捷、耗時少，但機體對SARS-CoV-2的免疫反應導致血清學檢測無法對COVID-19患者進行早期即時篩查，因此建議將核酸檢測與血清學檢測結合使用以提高COVID-19的檢測精度。此外，影像學檢查也是COVID-19的重要檢測手段，聯合應用可提供更加可靠的診斷結果[25]。

目前，疫情防控重點在于對無癥狀感染者進行有效監測，技術創新就顯得極為重要，提高靈敏度和準確度、高通量檢測、自動化、便攜等是目前新技術開發的主要方向。隨著上述新技術的發展，對COVID-19患者的檢測和診斷能力將進一步提高。