信號轉導及轉錄激活因子3、垂體同源框 1及膠質瘤相關癌基因同源蛋白- 1在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及臨床意義

馬瀟瀟，郭春香，陳官芝

青島大學附屬醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266000

皮膚惡性黑色素瘤為起源于外層胚葉神經嵴黑色素細胞的一類體表惡性腫瘤，其發(fā)病例數約占所有腫瘤的3%，居皮膚惡性腫瘤的第3位[1]。此外，研究顯示，皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)病主要與環(huán)境、遺傳性基因變異等因素有關，其中最為主要的外源性致病原因是皮膚暴露于紫外線照射中[2]。因皮膚惡性黑色素瘤在發(fā)病初期易發(fā)生轉移、侵襲，且治療難度較大，患者預后差、病死率高，因此探尋皮膚惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展的相關機制，對改善患者預后具有重大意義[3]。信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、垂體同源框1（pituitary homeobox l，PITX1）及膠質瘤相關癌基因同源蛋白-1（glioma-associated oncogene homoglog-1，Gli-1）在腫瘤組織中呈異常表達，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有緊密關系。但目前關于STAT3、PITX1及Gli-l在皮膚惡性黑色素瘤中作用機制的研究較為少見。基于此，本研究就STAT3、PITX1及Gli-l在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及臨床意義進行探討分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年8月至2020年8月于青島大學附屬醫(yī)院治療的皮膚惡性黑色素瘤患者的病歷資料。納入標準：①經病理檢查、CT檢查等證實，均符合皮膚惡性黑色素瘤診斷標準；②未接受相關治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、器官衰竭等；②合并精神疾病；③存在其他皮膚疾病；④有免疫系統疾病或結締組織病變。根據納入、排除標準，共納入89例皮膚惡性黑色素瘤患者，其中男50例，女39例；年齡37～68歲，平均（56.37±4.56）歲；TNM分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期17例。選取皮膚惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤組織﹥3 cm）。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有組織于手術切除后立即使用10%甲醛固定，切片后脫蠟、水化。采用免疫組化法進行檢測，將標本浸泡于3%過氧化氫中20 min，封閉其內源性過氧化物酶活性。高壓枸櫞酸鹽抗原修復，溫水清洗后使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次3 min，同時在其中滴加正常羊血清以阻斷非特異性結合，放入37℃孵育箱30 min。滴加一抗兔抗人STAT3多克隆抗體（1∶200）、兔抗人PITX1多克隆抗體（1∶200）、兔抗人Gli-1多克隆抗體（1∶150），4℃過夜，PBS再次清洗，滴加生物素標記的STAT3、PITX1、Gli-1蛋白二抗，以37℃孵育0.5 h，于第3次PBS清洗后，滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，采用蘇木素復染，于脫水、干燥后使用中性樹脂封片，用PBS代替一抗作為陰性對照。

根據陽性細胞百分比及染色情況判定STAT3、PITX1、Gli-1的表達情況[4-6]。陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。染色情況：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。總分為上述2項評分的乘積，≤3分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.3 觀察指標

對比腫瘤組織與癌旁組織中STAT3、PITX1、Gli-1表達情況。經回院復查、電話隨訪等方式了解皮膚惡性黑色素瘤患者的預后情況，隨訪1年，以發(fā)生復發(fā)或死亡作為預后不良的標準將其分為預后良好以及預后不良，比較預后良好及預后不良患者STAT3、PITX1、Gli-1蛋白表達情況，并對皮膚惡性黑色素瘤患者預后的影響因素進行分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素分析采用Logistic回歸分析；以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1表達情況的比較

腫瘤組織中STAT3、Gli-1蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織，PITX1陽性表達率明顯低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 腫瘤組織與癌旁組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較[ n（%）]

2.2 預后良好與預后不良患者腫瘤組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較

所有患者均成功完成隨訪，其中預后良好61例，預后不良28例。預后不良患者腫瘤組織中STAT3、Gli-1蛋白陽性表達率均高于預后良好患者，PITX1陽性表達率低于預后良好患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 預后良好與預后不良患者腫瘤組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較[ n（%）]

2.3 皮膚惡性黑色素瘤患者預后影響因素的單因素及多因素分析

Logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑≥5 cm、STAT3陽性、PITX1陰性、Gli-1陽性均為皮膚惡性黑色素瘤患者預后不良的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 皮膚惡性黑色素瘤患者預后影響因素的單因素及多因素分析

3 討論

黑色素瘤是由于黑色素細胞異常增生所形成的，屬于惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚及黏膜組織，據不完全統計，90%左右的黑色素瘤為皮膚黑色素瘤[7-8]。隨著近些年來檢測水平的提升，對于皮膚惡性黑色素瘤的檢出率也逐年提高，但由于皮膚惡性黑色素瘤發(fā)病較為隱匿，致使患者對其不夠重視，從而導致多數患者在就診時病情已發(fā)展至中晚階段，嚴重影響治療效果[9]。因此，對皮膚惡性黑色素瘤的致病機制進行深入了解，探尋皮膚惡性黑色素瘤的分子標志物，為臨床治療提供新思路，對改善患者的預后具有重要意義。

STAT3為信號轉導與轉錄激活因子家族成員，在多種因子的細胞轉導中起著重要作用。STAT3一般存在于細胞質中，在正常狀態(tài)下，STAT3僅會被短暫激活，持續(xù)時間僅為幾分鐘或者幾小時，而當機體出現腫瘤時，STAT3會處于持續(xù)激活的狀態(tài)，且會移位到細胞核中，并對目的基因的表達進行恒定調控，并促進腫瘤細胞的增殖、轉移[10]。目前較多研究已證實，STAT3在食管癌、胃癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中異常表達，但較少見STAT3在皮膚惡性黑色素瘤中的研究報道[11]。本研究結果顯示，腫瘤組織中STAT3陽性表達率明顯高于癌旁組織，且預后不良患者STAT3陽性表達率高于預后良好患者，提示STAT3可能在皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

PITXl屬于PITX轉錄因子家族成員，其與黑素細胞皮質素原基因的表達存在一定的聯系，并參與人體四肢的發(fā)育過程[12]。研究指出，PITX1為一種特殊的轉錄調節(jié)因子，其通過對細胞中端粒逆轉錄酶的轉錄激活發(fā)揮抑制作用，以影響細胞的增殖、分化，且PITXl還有著抑制致癌基因RAS轉錄活性的功能[13]。本研究中，腫瘤組織中的PITX1陽性表達率明顯低于癌旁組織，且預后不良患者PITX1陽性表達率低于預后良好患者，這說明PITXl可能對皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展起負性調控作用。Gli-l屬于Gli蛋白家族成員，為刺猬因子通路下游的一種重要轉錄因子，已被證實在髓母細胞瘤、肝癌及胃癌中異常表達[14]。且研究表明，Gli-l蛋白不僅是刺猬因子通路下游的效應點，且可能為癌變的致病機制信號通路的交叉點，可與其他信號通路的分子共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[15]。本研究中，腫瘤組織中Gli-1陽性表達率明顯高于癌旁組織，且預后不良患者Gli-1陽性表達率高于預后良好患者，進一步證實了上述觀點，說明可將Gli-l蛋白作為觀察皮膚惡性黑色素瘤患者預后情況的指標。本研究對皮膚黑色素瘤患者預后影響因素進行分析，得出腫瘤直徑≥5 cm、STAT3陽性、PITX1陰性、Gli-1陽性均為皮膚惡性黑色素瘤患者預后不良的獨立危險因素。綜上所述，STAT3、PITX1及Glil蛋白在皮膚惡性黑色素瘤中存在異常表達，通過檢測其水平能為臨床預后及治療提供新的思路與依據。