HPLC-ELSD 測(cè)定桔貝合劑中桔梗皂苷D 含量

洪挺，章瑛，周志強(qiáng)，陳丹丹，楊毅生

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

桔貝合劑處方來源于重慶市中醫(yī)研究所（原重慶市第一中醫(yī)院）的院方制劑——桔貝糖漿，后改為合劑，但為了矯味，處方中仍保留了20%的糖量。桔貝合劑的處方主要由桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉、甘草七味藥材組成，具有潤(rùn)肺止咳的功效，臨床上主要用于肺熱咳嗽、痰稠色黃、咳痰不爽等［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，桔貝合劑聯(lián)合布地奈德治療小兒支氣管炎、肺炎的痊愈率與有效率均有提高［2］。桔梗作為處方中的君藥之一，主歸肺經(jīng)，具有宣肺、利咽和排痰之功效。臨床主治痰多、咳嗽，胸悶不暢，喉嚨痛，聲音嘶啞，肺癰吐膿等癥狀［3］。桔梗藥材的主要化學(xué)成分為皂苷類、酚酸類、黃酮類、甾醇類等，而大量文獻(xiàn)均報(bào)道桔梗皂苷D 是其主要活性成分，具有祛痰止咳、抗腫瘤、抗炎、護(hù)肝、殺精、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等良好的藥理活性［4-10］。桔貝合劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第二冊(cè)），該標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀與檢查項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)非常簡(jiǎn)單，亟須提高。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前對(duì)桔貝合劑的研究主要集中在浙貝母、黃芩的含量測(cè)定和枇杷葉的薄層鑒別研究，而對(duì)君藥桔梗的研究未見報(bào)道［11-13］。本研究參照《中國藥典》2020年版一部中桔梗藥材的含量測(cè)定方法及有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3,14-17］，采用HPLC-ELSD 法對(duì)桔梗皂苷D 進(jìn)行含量測(cè)定研究，以便更好地控制桔貝合劑的質(zhì)量并保證其療效的發(fā)揮。

1 儀器與試藥

儀器：安捷倫1260Infinity Ⅱ型HPLC 色譜儀（美國安捷倫公司）；ELSD 檢測(cè)器（奧泰公司）；Sartorius BT25S 電子天平（十萬分之一，德國賽托利斯公司）。

試劑：乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

對(duì)照品：桔梗皂苷D（批號(hào)：111851-201103，含量以96.9%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）。

樣品：36 批次桔貝合劑（A 公司20 批次，B 公司9 批，C 公司7 批）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取桔梗皂苷D 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解后，制成0.3 mg/mL 的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取桔貝合劑樣品溶液20 mL，用水飽和正丁醇萃取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2 次，每次40 mL，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺桔梗的其他藥材，按處方工藝制成陰性樣品，再按“2.1.2”的方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 空白溶液的制備 取甲醇溶液，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25:75）；柱溫：20 ℃；ELSD 檢測(cè)器，漂移管溫度100 ℃；氣體流速2.5 mL/min。理論板數(shù)按桔梗皂苷D 峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

精密吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液及甲醇的空白溶液各10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，比較對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶液的色譜圖，結(jié)果陰性樣品及空白均無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.桔梗皂苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；D.空白

2.3 線性關(guān)系的考察

精密稱取10.46 mg 桔梗皂苷D 對(duì)照品，置10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解后，再稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品母液。再精密吸取該母液1、2、3、5 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品稀釋液，精密吸取對(duì)照品稀釋液和母液各10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，以Y（Lg 峰面積)為縱坐標(biāo)，X（Lg 進(jìn)樣量）為橫坐標(biāo)，作回歸方程，桔梗皂苷D 回歸方程為Y=1.581 7X+2.295 3，r=0.999 9。結(jié)果見表1。結(jié)果表明桔梗皂苷D 進(jìn)樣量在1.013 6～10.135 7 μg 之間與峰面積呈良好對(duì)數(shù)線性關(guān)系。

表1 桔梗皂苷D線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下HPLC 條件，連續(xù)進(jìn)針6 次，結(jié)果桔梗皂苷D 峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，符合實(shí)驗(yàn)測(cè)定要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（C 公司，批號(hào)：19090030）6 份，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果桔梗皂苷D 的平均含量為0.18 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下HPLC 條件，按間隔時(shí)間要求進(jìn)樣，結(jié)果桔梗皂苷D 色譜峰面積在24 h 內(nèi)無明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，表明桔梗皂苷D 在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，精密量取重復(fù)性項(xiàng)下已經(jīng)測(cè)定含量的本品（C 公司，批號(hào)：19090030，含桔梗皂苷D 0.18 mg/mL）6 份，每份10 mL，分別置分液漏斗中，精密加入桔梗皂苷D 對(duì)照品溶液（濃度1.013 6 mg/mL）2 mL，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法萃取4 次，每次30 mL，其余步驟同法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表2。

表2 桔梗皂苷D回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

取樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下方法，分別采用Phenomenex C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sunfire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種不同品牌的色譜柱進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果桔梗皂苷D 在上述色譜柱中均分離良好，桔梗皂苷D 測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，桔梗皂苷D 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，耐用性符合要求。

2.9 樣品測(cè)定

取樣品36 批，照前述方法制備和測(cè)定，從測(cè)定結(jié)果可知，不同企業(yè)樣品中桔梗皂苷D 含量差異巨大，其中A 公司樣品桔梗皂苷D 含量普遍偏低，且批間差異大。測(cè)得不同企業(yè)桔梗皂苷D 所測(cè)含量最高值比最低值高11 倍。測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 桔貝合劑樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

桔梗作為桔貝合劑處方中的君藥之一，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制存在必要性，而桔梗皂苷D 又是桔梗的主要活性成分，選用其作為含量測(cè)定指標(biāo)，研究意義大且專屬性較好。本研究在前期對(duì)桔梗皂苷D 進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其紫外吸收弱，因?yàn)榻酃Ｔ碥誅 沒有共軛基團(tuán)，只有一個(gè)碳碳雙鍵［18］，故而不能用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。ELSD 檢測(cè)器不依靠被檢測(cè)樣品的光學(xué)特性，對(duì)無紫外或紫外吸收較弱的樣品均可檢測(cè)，且ELSD 的響應(yīng)值是與樣品質(zhì)量成正比［17,19］。所以本研究選用HPLCELSD 方法對(duì)桔梗中的桔梗皂苷D 進(jìn)行含量測(cè)定。經(jīng)過多次色譜條件及樣品前處理等條件的摸索，最終選擇以乙腈-水（75∶25）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫、以水飽和的正丁醇作為提取媒介，ELSD的漂移管溫度100 ℃，氣體流速2.5 mL/min，此時(shí)的基線平穩(wěn)、峰形對(duì)稱、主峰與其他峰無干擾、雜質(zhì)峰較少。

從測(cè)定結(jié)果可知，不同企業(yè)樣品中桔梗皂苷D含量差異巨大，其中A 公司樣品桔梗皂苷D 含量普遍偏低，且批間差異大。測(cè)得不同企業(yè)桔梗皂苷D 含量最高值比最低值高11 倍。桔梗藥材在處方工藝中僅經(jīng)水煎煮，工藝簡(jiǎn)單，造成桔梗皂苷D 含量差異大，可能是不同企業(yè)所用桔梗藥材質(zhì)量差異造成的。由此可見，對(duì)桔梗藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制有一定的必要性與緊迫性。