冬蟲夏草治療免疫球蛋白A 腎病作用機制網(wǎng)絡藥理學研究*

蘇亞霞，趙愛華

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院藥劑科，上海 200025）

免疫球蛋白A（IgA）腎病是常見的慢性腎小球疾病，臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的肉眼血尿或鏡下血尿，且伴有不同程度的蛋白尿、高血壓、腎功能損害等，病情發(fā)展緩慢，約20%的患者在確診IgA 腎病后10 年內會進展為終末期腎臟疾病，需透析治療，嚴重影響患者的生活質量和壽命［1-2］。IgA 腎病主要根據(jù)患者尿檢情況、腎功能進展速度、是否合并高血壓、腎臟病理改變等進行個體化治療，盡可能地將蛋白尿控制為低于1 g/ d。《改善全球腎臟病預后組織（KDIGO）臨床實踐指南：腎小球腎炎》［3］建議，當?shù)鞍啄虺^0.5 g/d 時，推薦使用血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素受體拮抗劑類藥物，根據(jù)血壓情況調整藥物劑量，同時控制蛋白和鹽的攝入。蛋白尿控制不佳者，需給予糖皮質激素、免疫抑制劑等免疫抑制治療，但易產(chǎn)生多種藥品不良反應。冬蟲夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc. 是治療腎臟疾病的常用中藥［4］，含有蟲草酸、蟲草多糖、核苷、甾醇、氨基酸、維生素等化學成分［5］，具有抗菌、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)、保護肝腎功能等作用［6-11］。冬蟲夏草可防止糖尿病腎病的腎臟纖維化［12-13］；蛹蟲草可改善膜性腎小球腎炎［14］；蟲草菌粉制劑（百令片）可降低膜性腎病患者的蛋白尿［15］；冬蟲夏草提取物可通過抑制系膜細胞增殖［16］和減少系膜區(qū)免疫復合物沉積［17］，而延緩IgA 腎病的進展［18］。文獻［19-20］報道了冬蟲夏草治療糖尿病腎病和膜性腎病的網(wǎng)絡藥理學研究。本研究中采用網(wǎng)絡藥理學探討了冬蟲夏草治療IgA 腎病的藥效物質基礎及作用機制，為臨床治療IgA腎病提供新思路。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分篩選及靶點預測

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//tcmsp-e. com）查詢冬蟲夏草主要成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選冬蟲夏草的活性成分。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得活性成分的PubChem CID，通過PubChem CID 在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索并獲取Canonical SMILES 式；若活性成分的PubChem CID 信息缺失，則根據(jù)其化學名稱在PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得二維結構式的. sdf 文件。根據(jù)活性成分的Canonical SMILES 式或二維結構，利用Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：// www. swisstargetprediction. ch）預測活性成分的作用靶點，并通過Uniport 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）規(guī)范靶點蛋白的基因名稱。

1.2 活性成分- 靶點網(wǎng)絡構建

將篩選出的藥物活性成分及規(guī)范處理后的靶點蛋白導入Cytoscape 3.7.2 軟件進行拓撲學分析，利用“Network Analyzer”功能分析節(jié)點的度值。度值越大，表明藥物活性成分涉及的生物功能越多，生物學重要性也越高。

1.3 IgA 腎病相關靶點預測

以“IgA Nephropathy”為檢索詞，通過人類基因綜合數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：// www. genecards. org）檢索IgA 腎病相關的靶點蛋白，根據(jù)度值篩選與疾病密切相關的靶點；并檢索OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org）補充IgA 腎病靶點。將篩選結果取并集，并刪除重復值，利用Uniport數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點蛋白名稱。

1.4 冬蟲夏草治療IgA 腎病網(wǎng)絡可視化分析

將獲取的疾病靶點蛋白與藥物靶點蛋白導入在線工具Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index. html），獲取交集靶點，即冬蟲夏草治療IgA 腎病的潛在靶點，結合冬蟲夏草治療IgA 腎病的主要活性成分，采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制藥物- 活性成分-疾病-靶點可視化網(wǎng)絡圖。

1.5 潛在核心靶點相互作用網(wǎng)絡構建

將冬蟲夏草與IgA 腎病的交集靶點蛋白上傳至String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string - db.org），物種選擇為“Homo sapiens（Human）”；最低要求交互分數(shù)“minimum required interaction score”設置為“medium confidence（0.400）”，得到蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）。下載該網(wǎng)絡的.tsv格式文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析，利用“Network Analyzer”功能對PPI 進行拓撲學分析，根據(jù)網(wǎng)絡節(jié)點的特征參數(shù)，計算各節(jié)點的度值，篩選冬蟲夏草治療IgA腎病的潛在核心靶點。

1.6 基因本體（GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將冬蟲夏草與IgA 腎病的共有靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），對潛在靶點進行GO生物過程分析和KEGG通路富集分析。P＜0.01為顯著富集，運用R 語言對排名前10 的生物過程及通路進行可視化處理，篩選潛在靶標可能涉及的生物學過程及通路。

2 結果

2.1 藥物主要活性成分及靶點

通過檢索TCMSP，PubChem，Swiss TargetPrediction，Uniport數(shù)據(jù)庫，共獲得冬蟲夏草的活性成分7個（見表1），藥物靶點167個。

表1 冬蟲夏草活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active components of Cordyceps

2.2 活性成分- 靶點網(wǎng)絡構建與分析

將7 個冬蟲夏草活性成分和167 個藥物靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制藥物活性成分- 靶點網(wǎng)絡（見圖1）。冬蟲夏草中節(jié)點的度值較大，涉及生物過程較多，可能具有較大藥用價值的活性成分有酒酵母甾醇、膽固醇棕櫚酸酯、過氧麥角甾醇、花生四烯酸、β-谷甾醇。

圖1 冬蟲夏草活性成分-靶點網(wǎng)絡Fig.1 Network of active components of Cordyceps-targets

2.3 IgA 腎病相關靶點

以“IgA Nephropathy”為檢索詞，通過檢索Gene-Cards，OMIM 數(shù)據(jù)庫，利用Uniport 數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點蛋白名稱，共獲得1 336個與IgA腎病相關的靶點。

2.4 冬蟲夏草治療IgA 腎病網(wǎng)絡可視化分析

將1 336個IgA腎病靶點與167個藥物靶點蛋白導入在線工具Venny 2.1.0，共獲得50個交集靶點（見圖2）。結合冬蟲夏草的7 個主要活性成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡（見圖3），共得到網(wǎng)絡關系134條。

圖2 冬蟲夏草與IgA腎病交集靶點的維恩圖Fig.2 Venny diagram of intersection of Cordyceps targets and IgA nephropathy targets

圖3 冬蟲夏草治療IgA腎病的藥物-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡Fig.3 Network of drugs-active components-diseases-targets of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

2.5 潛在核心靶點相互作用網(wǎng)絡構建與分析

將50個交集靶點蛋白上傳至String數(shù)據(jù)庫，構建核心靶點PPI，借助Cytoscape 3.7.2 軟件對其進行拓撲學分析，并計算各節(jié)點的度值。由圖4可知，該網(wǎng)絡共包含49 個節(jié)點（其中1 個為游離靶點，舍棄），217 條邊。圓形越大，表示度值越大；線條越粗，表示互作分數(shù)越高。該網(wǎng)絡中度值的平均值為9.5，度值大于平均值的靶點有15個，分別為腫瘤壞死因子（TNF），Scr家族酪氨酸激酶（SFK），表皮生長因子受體（EGFR），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），環(huán)加氧酶2（PTGS2），雌激素受體1（ESR1），過氧化物酶體增殖物激活受體ɑ（PPARɑ），激酶插入?yún)^(qū)域受體（KDR），核受體亞家族3C組成員1（NR3C1），鼠雙微體基因2（MDM2），細胞色素P450 家族19 亞家族A 成員1（CYP19A1），絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），孕酮受體（PGR），三磷酸腺苷結合盒轉運子B 亞家族成員1（ABCB1），淀粉樣前體蛋白（APP）。其中，TNF，SFK，EGFR，PPARγ，PTGS2，ESR1的度值均大于雙倍均值，可能是冬蟲夏草治療IgA 腎病的核心靶點。

圖4 冬蟲夏草治療IgA腎病的潛在核心靶點蛋白互作網(wǎng)絡Fig.4 PPI network of potential core targets of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

2.6 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析

GO 生物過程分析共富集到180 條生物過程，其中顯著富集（P＜0.01）的生物過程有65條。根據(jù)P值升序排列，取前10 條生物過程以氣泡圖展示（見圖5）。結果顯示，冬蟲夏草主要通過對甾體激素的反應、小分子代謝過程的調控、脂質代謝過程的調控、炎性反應的調控、細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）1 和ERK2 級聯(lián)反應的調控等生物過程治療IgA腎病。

圖5 冬蟲夏草治療IgA腎病的GO生物過程分析氣泡圖Fig.5 Bubble map of GO biological process analysis of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

KEGG 通路富集分析富集到50 條通路，其中顯著富集（P＜0.01）的通路有12 條。根據(jù)P值升序排列，取前10 條生物過程以氣泡圖展示（見圖6）。結果顯示，冬蟲夏草主要通過人類巨細胞病毒感染、Rap1信號通路、內分泌抵抗、C 型凝集素受體信號通路、血管內皮生長因子信號通路等治療IgA腎病。

圖6 冬蟲夏草治療IgA腎病的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble map of KEGG pathway enrichment analysis of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

3 討論

IgA 腎病是臨床常見的腎小球疾病，在亞洲地區(qū)發(fā)病率較高，約占原發(fā)性腎小球疾病的35%～55%［21］，約20%～40%的IgA 腎病后期可發(fā)展為腎功能不全甚至終末期腎臟病［22-23］。目前，臨床主要應用ACEI、血管緊張素受體拮抗劑、糖皮質激素、免疫抑制劑等進行治療，有一定療效，但隨著病程的遷延、治療周期的延長，藥品不良反應凸顯。

冬蟲夏草藥用歷史悠久，可追溯的相關漢文字始載于《四川通志》，《本草從新》《本草綱目拾遺》也記載其有保肺、益腎、止血、化痰等功效。歷版《中國藥典》均將冬蟲夏草收錄在內，其功能與主治為補腎益肺、止血化痰，用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血。現(xiàn)代研究證實，冬蟲夏草對腎臟具有顯著的保護作用，如冬蟲夏草制劑與ACEI 或血管緊張素受體拮抗劑類藥物合用對慢性腎臟病的愈后優(yōu)于單用上述2類藥物［24-25］。黃燕萍等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草能提高機體的免疫功能，增強單核巨噬細胞的吞噬功能，抑制IgA 腎病大鼠免疫復合物的沉積，減輕腎臟病理變化，延緩IgA 腎病進展。崔美玉［26］對30 例經(jīng)活檢確診為IgA 腎病的患者在給予內科治療的基礎上加用冬蟲夏草水煎劑口服，有效率為86.7%，提示冬蟲夏草對IgA腎病的治療效果確切。XIAO 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草可能通過調節(jié)小鼠Th22 細胞的趨化性，以抑制IgA 腎病的炎性反應。

本研究中采用網(wǎng)絡藥理學方法對冬蟲夏草治療IgA 腎病的潛在作用機制進行系統(tǒng)性預測，結果冬蟲夏草共包含7 個主要活性成分，對應167 個藥物靶點，共獲得IgA 腎病靶點1 336 個，50 個冬蟲夏草治療IgA 腎病的潛在作用靶點；通過構建PPI，篩選得到冬蟲夏草治療IgA 腎病的6 個核心靶點，即TNF，SFK，EGFR，PPARG，PTGS2，ESR1。TNF 可引起細胞凋亡，是機體炎性和免疫反應的重要調節(jié)因子，其中TNF-α 與IgA 腎病病情的進展呈正相關，可刺激系膜細胞表達黏附分子，促進腎纖維化的進展［27-28］。SFK可參與調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移及血管形成等多種生物學過程，在各種慢性腎臟病的腎纖維化中發(fā)揮著關鍵作用［29］。EGFR是一種受體酪氨酸激酶，廣泛表達于細胞膜表面，活化后可引起蛋白表達、細胞分裂與增殖等，抑制EGFR 的表達可明顯減少足細胞損傷和凋亡，以及抑制腎小管上皮細胞凋亡，保護腎臟［30］。PPARG 在腎臟、肝臟、脂肪等組織中均有不同程度的表達，參與多種生理及病理過程，包括炎性反應、細胞凋亡、脂肪細胞的分化等生理及病理過程，多種抗纖維化微小核糖核酸受轉錄因子PPARG 的調控，PPARG 可能是抗纖維化治療的靶點［31］。PTGS2 主要參與炎性調節(jié)和氧化應激等生理病理過程，腎臟病患者普遍存在微炎性狀態(tài)，且氧化應激與腎臟病的發(fā)生、發(fā)展密切相關［32］。ESR1 基因可編碼雌激素受體，雌激素是已知的單核細胞/巨噬細胞調節(jié)劑，與雌激素受體結合后可活化靶基因轉錄，抑制核因子κB的表達，參與機體的炎性反應和免疫應答，調節(jié)細胞的凋亡和應激反應［33］。

GO 生物過程分析結果顯示，冬蟲夏草治療IgA 腎病可能涉及的生物過程包括對甾體激素的反應、小分子代謝過程的調控、脂質代謝過程的調控、炎性反應的調控、ERK1 和ERK2 級聯(lián)反應的調控等。甾體激素包括腎上腺皮質激素和性激素兩大類，其中腎上腺皮質激素具有抗炎、抗過敏、免疫抑制等重要生理和藥理學作用［34］，腎臟疾病的發(fā)生常伴有炎性反應，減輕炎性反應能改善腎功能損傷［35］，免疫抑制是腎臟疾病治療的常用手段。許多小分子代謝產(chǎn)物參與細胞的凋亡和自噬過程［36］，在腎臟疾病中足細胞過度凋亡和自噬會引發(fā)蛋白尿。脂質代謝異常與腎功能損傷關系密切，高脂血癥可通過損傷血管內皮細胞、腎小球上皮細胞、系膜細胞導致脂質腎毒性［37］。ERK1 和ERK2 級聯(lián)反應參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種細胞生物學過程的調控［38］。

KEGG 通路富集分析結果顯示，冬蟲夏草治療IgA腎病可能通過人類巨細胞病毒感染、Rap1信號通路、內分泌抵抗、C 型凝集素受體信號通路、血管內皮生長因子信號通路等。巨細胞病毒普遍存在，且多數(shù)是人類巨細胞病毒，巨細胞病毒感染是免疫功能障礙的標志，也是慢性疾病的病因，可導致間質性腎炎的發(fā)生、發(fā)展，促進腎小球系膜細胞增殖、足細胞脫落、腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化等［39］。Rap1 信號通路可調節(jié)腎臟對水和鈉的重吸收，介導腎臟纖維化及腎小管細胞的增殖、凋亡等［40］。腎臟疾病患者會出現(xiàn)代謝及內分泌紊亂，其中生長激素- 胰島素樣生長因子軸在調節(jié)腎臟細胞的增生及腎血流量等方面發(fā)揮著重要作用，腎小球足細胞可表達功能性生長激素受體，生長激素能提升活性氧的水平，并誘導這些細胞中肌動蛋白細胞骨架的重組，提示生長激素的作用與腎小球功能障礙之間的新機制聯(lián)系［41-42］。此外，胰島素抵抗會加重IgA 腎病腎小管間質病變［43］。C 型凝集素可識別廣泛的配體，并調節(jié)多種生理功能，在自身免疫性疾病中具有重要作用，與腎臟疾病中炎癥的持續(xù)發(fā)生相關［44］。血管內皮生長因子是內皮細胞的特殊生長因子，可促進內皮細胞的增殖和分化、血管形成等，主要在腎小球足細胞中表達，對腎臟疾病的動態(tài)觀察、治療及預后有十分重要的作用［45］。冬蟲夏草治療IgA腎病可能主要通過調節(jié)免疫、抗炎、減少足細胞凋亡、抑制系膜細胞增殖等機制而發(fā)揮保護腎臟、延緩疾病進展的作用。

綜上所述，基于網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草治療IgA 腎病的作用機制，涉及多種活性成分、多個作用靶點、多條通路及生物過程。但由于本研究只是基于數(shù)據(jù)庫進行預測，具體的藥物作用機制仍需進一步的研究加以驗證。