兩種布洛芬共晶與牛血清白蛋白作用機制研究*

范 瑩，張帥華，楊 釗

（1. 中國人民解放軍海軍青島特勤療養中心，山東 青島 266071； 2. 山東大學藥學院，山東 濟南 250012；

3. 山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071）

大多數藥物通過靜電作用、氫鍵及范德華力等非共價相互作用與血漿蛋白可逆地結合，隨血液運送至機體各個部位，轉化為游離態后發揮作用。白蛋白是血漿中重要的藥物結合蛋白，豐度最高，相對分子質量較?。?-3］，不僅可影響藥物在體內的轉運、分布和代謝［4］，還能解毒，影響藥效發揮［5］。因此，研究藥物與蛋白質的相互作用，有助于闡明藥物的體內過程及作用機制［6-7］。布洛芬是臨床常用非甾體解熱鎮痛抗炎藥，水溶性差，生物利用度不高。布洛芬- 異煙酰胺（IBU -INA）和布洛芬-2-吡啶甲酰胺（IBU-2PA）共晶［8］可提高其水溶性，但2 種共晶如何與蛋白質結合，是否會影響布洛芬與血漿蛋白的相互作用，進而影響藥效的發揮，尚無系統研究。本研究中采用熒光光譜法和紫外吸收光譜法探討了2 種布洛芬共晶與白蛋白的相互作用機制。由于牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白（HSA）具有相似的結構和相近的相對分子質量［9］，且價格低廉、易獲得，故本研究中以BSA 替代HSA［10］?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2600 型紫外分光光度計（日本島津公司）；F-4500型熒光光譜儀（日本日立公司）；DK-S24型數顯恒溫水浴鍋（上海柏欣儀器設備廠）；微量移液槍（德國Brand 公司）；BT125D 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為萬分之一）。

1.2 試藥

布洛芬原料藥（山東新華制藥股份有限公司）；異煙酰胺對照品（批號為FGE01AHFI），2 - 吡啶甲酰胺（批號為LU90S100），純度均為99.8%，購于北京百靈威科技有限公司；BSA（相對分子質量為68 000，蛋白質≥95%，北京索萊寶科技有限公司，批號為929F052）；甲醇、乙腈，均為色譜純，購于德國默克公司。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 溶液制備

BSA 溶液：取BSA 68 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加入適量蒸餾水溶解并定容，精密量取上述溶液

12.5 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，即得。

布洛芬、共晶溶液：分別取10 mg 布洛芬、相當摩爾量的布洛芬共晶（IBU-INA 和IBU-2PA），精密稱定，分別溶于10 mL甲醇中，即得。

2.1.2 光譜測定

精密量取BSA 溶液3 mL，共7 份，以5 μL 梯度從0開始分別加入布洛芬溶液（猝滅劑），試驗溫度下水浴恒溫30 min。于285 nm 檢測波長處，激發和發射狹縫寬度為4 nm 條件下掃描290～450 nm 波長范圍BSA 在布洛芬作用下的熒光猝滅光譜［11］。同法，測定加入以2 種布洛芬共晶為猝滅劑時BSA的熒光猝滅光譜。

取2.1.1 項下布洛芬及其2 種共晶溶液，分別稀釋1 000 倍，測定290～450 nm 波長范圍的紫外吸收光譜，并掃描同波長范圍BSA 溶液的熒光光譜，以及BSA 與藥物摩爾比為1∶1時BSA的熒光光譜。

2.2 結果

2.2.1 熒光猝滅光譜

不同試驗溫度下，在BSA 溶液中加入不同量的布洛芬及其2 種共晶后，BSA 熒光猝滅光譜見圖1。結果表明，隨著猝滅劑加入量的增多，BSA 的熒光強度不斷減弱，說明藥物及其共晶均與BSA 發生了相互作用，而熒光光譜的峰位卻無明顯變化，提示布洛芬及其2 種共晶可能未改變熒光發色團的極性。

2.2.2 熒光猝滅類型

熒光猝滅根據猝滅機制的不同可分為靜態猝滅和動態猝滅［12］，根據常用猝滅常數隨溫度的變化趨勢來判斷猝滅類型［13-15］。無論靜態猝滅還是動態猝滅均遵循Stern-Volmer方程。見公式（1）。

式中，F0為純BSA 溶液的熒光強度，F為加入猝滅劑后BSA 溶液的熒光強度，Kq為猝滅常數，τ0為生物大分子內源性熒光壽命，約為10-8s，［Q］為猝滅劑（加入藥物）的濃度，Ksv為Stern-Volmer猝滅常數［16-20］。

A1，A2. 布洛芬（32，40 ℃） B1，B2.IBU-INA（32，40 ℃） C1，C2.IBU-2PA（32，40 ℃）圖1 布洛芬及其共晶在不同溫度下BSA的熒光猝滅光譜Note：Curves 1 to 7 indicate that the volume of quencher added increases in a gradient of 5 μL.A1，A2.Ibuprofen（32，40 ℃） B1，B2.IBU-INA（32，40 ℃） C1，C2.IBU-2PA（32，40 ℃）Fig.1 Fluorescence quenching spectra of ibuprofen and ibuprofen co -crystals interacted with BSA at different temperatures

A. 布洛芬與BSA B.IBU-INA與BSA C.IBU-2PA與BSA圖2 不同溫度下布洛芬及其共晶與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線A.Ibuprofen and BSA B.IBU-INA and BSA C.IBU-2PA and BSAFig.2 Stern-Volmer curves of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA at different temperatures

不同試驗溫度下，布洛芬及其共晶與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線見圖2。擬合得到的Stern-Volmer方程和參數見表1?？芍瑴囟壬撸绯礙sv減小，32 ℃和40 ℃溫度條件下的Kq值均明顯大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅常數2.0×1010L/（mol·s），這與靜態猝滅的特征一致［21-22］，提示布洛芬在形成共晶后仍具有與血漿蛋白結合形成復合物的能力。

表1 布洛芬及其共晶與BSA相互作用的Stern-Volmer方程及速率常數Tab.1 Stern-Vlomer equations and rate constants of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

2.2.3 表觀結合常數

對于靜態猝滅過程，可由修正的Stern - Volmer 方程求出其結合反應的結合常數［23］，用以判斷藥物分子與蛋白質的親和能力。見公式（2）。

式中，F0為BSA 溶液的熒光強度，F為加猝滅劑后BSA 的熒光強度，KA為表觀結合常數，n為結合位點數，［Q］為藥物濃度。以lg［Q］為橫坐標、lg［（F0-F）/F］為縱坐標作圖（圖3），根據以上修正方程擬合得到的線性方程和參數見表2?？芍?，隨著試驗溫度的升高，表觀結合常數呈下降趨勢。這是由于猝滅劑與BSA 的結合具有可逆性，隨著溫度的升高，兩者間的結合力逐漸減弱，猝滅劑-BSA復合物的穩定性也不斷降低，符合靜態猝滅特征。32 ℃時，布洛芬與BSA 的結合常數為1 545 L/mol，2 種共晶IBU-INA 和IBU- 2PA 與BSA 的結合常數分別為2 074 L/mol 和1 303 L/mol。提示2 種布洛芬共晶與BSA均具有較強的結合能力。

表2 布洛芬及其共晶與BSA相互作用的表觀結合常數Tab.2 Apparent binding constants of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

2.2.4 作用力類型

根據反應前后熱力學吉布斯自由能變化（ΔG）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）闡明藥物與BSA 的主要相互作用力類型至關重要。當ΔH＞0，ΔS＞0時為疏水作用力；當ΔH＜0，ΔS＜0 時為氫鍵和范德華力；當ΔH＜0，ΔS＞0時為靜電引力。當溫度變化不大時，焓變ΔH可看作常數，根據公式（3）、公式（4）、公式（5）［24］分別求出ΔG，ΔH，ΔS，結果見表3。

表3 布洛芬及其2種共晶與BSA相互作用的熱力學參數Tab.3 Thermodynamic parameters of ibuprofen and two ibuprofen co-crystals interacted with BSA

A. 布洛芬與BSA B.IBU - INA與BSA C.IBU - 2PA與BSA圖3 布洛芬及其共晶與BSA相互作用修正的Stern-Volmer曲線A.Ibuprofen and BSA B.IBU-INA and BSA C.IBU-2PA and BSAFig.3 Modified Stern-Volmer curves of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

式中，R為氣體常數，T，T1，T2均為溫度，KA，K1，K2均為結合常數。

結果顯示，當試驗溫度為32 ℃和40 ℃時，ΔH和ΔS均小于0。因此，在布洛芬及其共晶與BSA 的相互作用中，氫鍵和范德華力可能起了主要作用。ΔG小于0，有利于反應的自發進行，說明藥物與BSA 的結合是自發進行的。

2.2.5 結合距離

根據F?ster 提出的熒光共振能量轉移（FRET）理論，可計算出藥物與生物大分子之間的距離。FRET 程度與供、受體分子的空間距離密切相關，一般空間距離≤7 nm 時即可發生FRET，隨著距離的增大，FRET 呈現明顯減弱趨勢［25］。FRET 的轉移效率與供體-受體間結合距離r和臨界能量轉移距離R0的關系見公式（6）。

式中，F0為BSA 溶液的熒光強度，F為加入猝滅劑時BSA的熒光強度。R0可由公式（7）求出。

式中，K2為偶極空間取向因子，N為介質的折射常數，Ф為熒光量子產率，J為給體熒光發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分面積J（λ）可由公式（8）求出。

式中，F（λ）為給體的熒光強度，ε（λ）為受體摩爾消光系數。

BSA 的熒光發射光譜和布洛芬及其2 種共晶的紫外吸收光譜見圖4，計算得到R0和r，結果見表4。其中，布洛芬與BSA 結合距離r為1.19 nm，2 種共晶IBU -INA 和IBU-2PA 與BSA 的結合距離分別為1.22 nm 和1.31 nm，均小于7 nm，這說明布洛芬及其共晶與BSA作用時發生了非輻射能量轉移。

表4 布洛芬及其2種共晶與BSA相互作用時能量轉移參數Tab.4 Energy transfer parameters of ibuprofen and two ibuprofen co-crystals interacted with BSA

3 討論

本課題組前期研究發現，制備的2種布洛芬共晶可提高布洛芬的水溶性，而藥物發揮作用還需通過與血漿蛋白結合，由血液運輸到全身各處靶細胞來實現，故本研究中采用熒光光譜法和紫外吸收光譜法對2 種布洛芬共晶與血漿蛋白的相互作用機制進行了初步探討。

A. 布洛芬 B.IBU - INA C.IBU - 2PA圖4 BSA的熒光發射光譜和布洛芬及其共晶的紫外吸收光譜A.Ibuprofen B.IBU-INA C.IBU-2PAFig.4 Fluorescence emission spectrum of BSA，ultraviolet absorption spectrum of ibuprofen and ibuprofen co -crystals

蛋白質中的芳香族氨基酸殘基的側鏈基團可吸收紫外區域的入射光，從而發射熒光特性。而藥物共晶作為熒光猝滅劑，可減弱蛋白質的熒光強度。因此，根據梯度體積的布洛芬共晶溶液對BSA 熒光強度的猝滅作用及不同溫度下猝滅效果的變化，發現布洛芬共晶可與血漿蛋白相結合。本研究結果顯示，隨著藥物共晶加入量的增多，BSA 的熒光強度呈現減弱趨勢，提示布洛芬形成共晶后依然可使BSA 發生熒光猝滅，不影響布洛芬與BSA 的結合。升高溫度會減弱熒光猝滅效果，說明此過程為靜態猝滅。在藥物共晶與蛋白質分子相互作用中，主要作用力為氫鍵和范德華力，結合常數的數據表明共晶與BSA 的結合能力較強，其結合距離r均小于7 nm，提示兩者相互作用時能量發生了轉移。藥物與血漿蛋白的結合能力是影響藥物體內過程的重要因素，本研究中布洛芬形成共晶后不會改變布洛芬與血漿蛋白的作用和結合能力，這為今后研究共晶在生物體內的藥代動力學過程提供了依據，對共晶技術在新藥研發中的應用具有積極意義。