高效液相色譜法同時測定口腔潰瘍油中鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定含量*

熊 英，雷 健，邢 茂

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥學部，重慶 400037）

口腔潰瘍油主要由醋酸氯己定、醋酸潑尼松龍、鹽酸達克羅寧、冰片、鞣酸等配伍制成，可改善口腔潰瘍癥狀，治療口腔潰瘍的療效顯著。其中，醋酸氯己定可殺菌、消炎［1-3］；醋酸潑尼松龍有抗炎作用［4］；鹽酸達克羅寧有止痛功效［5］；冰片可止痛消腫［6］；鞣酸可減輕皮膚或黏膜的炎癥，在炎癥表面使蛋白質(zhì)形成一層保護膜，減輕外界對神經(jīng)末梢的刺激作用，消除痛覺和局部血管的擴張反應［7-8］。口腔潰瘍油原質(zhì)量標準未完全解決鞣酸對主要成分測定的干擾，以及醋酸氯己定的色譜峰形的展寬和拖尾問題［9］。本研究中建立了同時測定口腔潰瘍油中醋酸氯己定和鹽酸達克羅寧含量的高效液相色譜（HPLC）法［10-13］，以提高口腔潰瘍油的質(zhì)量標準。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），包括G7114A VWD 檢測器和Chemstation 工作站；PB-10 型pH 計（上海雷磁儀器有限公司）；ME235S型電子天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

口腔潰瘍油（陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院制劑室，批號分別為141219，150310，150416，150506）；鹽酸達克羅寧對照品（批號為100423-201102，含量為99.8%），醋酸氯己定對照品（批號為100183 - 201003，含量為96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Honeywell 公司）；磷酸二氫鉀（色譜純，阿拉丁試劑＜上海＞有限公司）；冰醋酸（分析純，重慶川東化工集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液（B，冰醋酸調(diào)pH 至2.5），梯度洗脫（0～20 min 時45%A，20～21 min 時45%A～60%A，21～30 min 時60%A，30～31 min 時60%A～45%A，31～35 min 時45%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：259 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取醋酸氯己定對照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用初始比例流動相［甲醇- 磷酸鹽緩沖液（45∶55，V/V）］溶解并定容，搖勻，作為醋酸氯己定對照品濃溶液。取鹽酸達克羅寧對照品25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，精密量取醋酸氯己定對照品濃溶液5 mL，加入同一容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，即得混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

取樣品，用移液管精密量取2 mL，置200 mL容量瓶中，用甲醇分次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中。加甲醇適量，振搖使溶解，再加流動相稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。

按處方工藝配制缺醋酸氯己定和鹽酸達克羅寧的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果相鄰峰之間的分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：精密量取2.2項下混合對照品貯備液10 mL，置50 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得200%對照品溶液。分別精密量取200%對照品溶液8，6，5，4，3，2 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定的回歸方程分別為Y鹽=15 505.066 3X鹽-1.709 0，r= 0.999 8（n =7）；Y醋= 31 759.537 6X醋-7.048 2，r=0.999 8（n=7）。結果表明，鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定的質(zhì)量濃度分別在39.23～196.17 μg/mL和3.87～19.35 μg/mL 范圍內(nèi)與各自峰面積的線性關系良好。

1. 鹽酸達克羅寧 2. 醋酸氯己定A. 陰性對照品溶液 B. 混合對照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Dyclonine hydrochloride 2.Chlorhexidine acetate A.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定峰面積的RSD分別為0.35%和0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為141219）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液6 份，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定的含量。結果的RSD分別為0.50%和0.63%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為141219）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定峰面積的RSD分別為0.55%和0.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取醋酸氯己定對照品適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解，制成醋酸氯己定對照品濃溶液。取鹽酸達克羅寧對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，精密量取醋酸氯己定對照品濃溶液20 mL，加入同一容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取已知含量的供試品溶液1 mL（鹽酸達克羅寧9.638 mg/mL，醋酸氯己定0.948 mg/mL），共9 份，置200 mL 容量瓶中，分別加入混合對照品貯備液8，10，12 mL，用流動相稀釋并定容，搖勻。按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：取樣品（批號為141219）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，適當調(diào)整色譜條件參數(shù)，在不同色譜條件下測定樣品含量，考察方法的耐用性。結果鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定含量的RSD分別為0.95%和1.37%（n= 9），表明不同色譜條件對測定結果均無顯著影響，方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為150310，150416，150506）樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定的含量，結果見表2。

表2 鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定含量測定結果（%）Tab.2 Results of content determination of dyclonine hydrochloride and chlorhexidine acetate（%）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

樣品中鹽酸達克羅寧濃度是醋酸氯己定的10 倍，故同時測定鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定時選擇醋酸氯己定的最大吸收波長（259 nm）作為檢測波長，此波長處鹽酸達克羅寧的吸光度也能滿足檢測要求。

3.2 色譜柱和流動相選擇

醋酸氯己定結構中含有多個仲胺基和亞胺基，與硅膠表面的硅醇基有較強的氫鍵作用和親硅醇基效應［14-16］，使用常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，并嘗試用不同流動相檢測醋酸氯己定，其色譜峰的拖尾均較嚴重。為了改善峰形，使各組分能選擇性地分離，選擇辛烷基硅烷鍵合硅膠柱，以甲醇- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液為流動相。試驗中發(fā)現(xiàn)，降低流動相的pH能顯著改善醋酸氯己定的峰形，同時，考慮色譜柱對pH的耐受性，調(diào)節(jié)流動相pH 值至2.5。用以上色譜條件檢測樣品，可使干擾成分鞣酸在5 min 內(nèi)快速出峰，且大幅減少鞣酸的色譜峰拖尾，很好地解決了鞣酸對主成分測定的干擾，使鹽酸達克羅寧、醋酸氯己定和鞣酸的色譜峰均達到基線分離。

3.3 方法評價

本研究中所建立的方法專屬性強、分離度高，鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定的保留時間適宜，其他組分干擾小，操作簡便，結果準確，重復性、耐用性均良好，可用于提升口腔潰瘍油的質(zhì)量標準。