難溶性香菇多糖無菌原料藥細菌內毒素定量檢測方法建立

丁蘇蘇，葉嬋娟，姚晶晶，李倚云

（江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225000）

香菇Lentinus edodes又稱香蕈、冬菰，營養豐富，味道鮮美，被視為“菇中之王”，是我國久負盛名的珍貴食用菌，也是我國著名的藥用菌，歷代醫藥學家對香菇的藥性及功效均有著述［1-2］。香菇多糖提取自香菇子實體，是香菇的主要有效成分，具有抗腫瘤、增強免疫功能、抗病毒、刺激干擾素形成等多種作用［3-4］。作為免疫輔助藥物，香菇多糖可抑制腫瘤的發生、發展與轉移，提高腫瘤對化療藥物的敏感性，改善患者的身體狀況，并延長其生命，治療胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等的療效良好［5-6］。本研究中參考2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細菌內毒素檢查法［7］178-181，對香菇多糖無菌原料藥中的細菌內毒素進行了動態濁度檢查方法學［8］研究，同時考察了研磨法溶解樣品的干擾性及回收率，為該產品采用動態濁度法進行細菌內毒素檢查提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VERSA max 型酶標儀（美谷分子儀器＜上海＞有限公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司，精度為0.01 mg）；ZH-2 型自動旋渦混合器（天津藥典標準儀器廠）。研缽和試管均置金屬容器中，于250 ℃烘箱中放置至少30 min，以去除可能存在的外源性內毒素。

1.2 試藥

香菇多糖無菌原料藥（南京某制藥有限公司，批號分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103，灰棕色顆粒）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-201987，規格為每支80 EU）；細菌內毒素檢查（BET）用水（批號為1909250，規格為每瓶50 mL），動態濁度法鱟試劑（批號為1912090，規格為每支1.25 mL，檢測范圍為10～0.01 EU/ mL），細菌內毒素檢查反應板（批號為190603-078），均購自湛江安度斯生物有限公司；動態濁度法鱟試劑（福州新北生化工業有限公司，批號為19071812，規格為每支0.5 mL，檢測范圍為

10～0.01 EU/mL）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）確定

臨床治療時，注射用香菇多糖的使用劑量為1 周2 次，每次1 mg，用2 mL 滅菌注射用水振搖溶解，加250 mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液，靜脈滴注。按公式L=K/（f·M）計算，其中，L為供試品的細菌內毒素限值；K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K為5 EU/（kg·h）；f為安全系數，由于本品為抗腫瘤輔助治療藥，為保證用藥安全，根據指導原則，f取值為3［7］516-517；M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，人均體質量按60 kg 計算，則L為100 EU/mg。

2.2 供試品最大有效稀釋倍數（MVD）確定

香菇多糖無菌原料藥為分子量較大的多糖物質，未經過制劑工藝處理時，在水中極微溶解［5］。制備樣品時，先在無熱原研缽中將顆粒狀香菇多糖無菌原料藥輕輕壓碎，研磨成細粉，加入適量BET 用水，繼續研磨至香菇多糖溶散于其中，形成透明、均勻的溶液后，再用BET 用水稀釋至質量濃度為0.2 mg / mL 的供試品溶液。按公式MVD =C·L/λ計算，其中，L為供試品的細菌內毒素限值，λ為標準曲線上最低的內毒素濃度，C為供試品溶液的濃度。本品L為100 EU/mg，λ為0.031 25 EU/mL，則MVD為640倍。

2.3 標準曲線建立與可靠性試驗

取細菌內毒素工作標準品1 支，用BET 用水溶解，并稀釋成終濃度分別為2.000 00，0.500 00，0.125 00，0.031 25 EU/mL 的系列標準曲線溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至預先加有0.1 mL 鱟試劑的細菌內毒素檢查反應板內，每個濃度平行3管。同時，以BET用水作陰性對照，平行2管。采用酶標儀測定，以細菌內毒素濃度對數值（lgC）為橫坐標、平均反應時間對數值（lgT）為縱坐標繪制標準曲線，2批（安度斯，批號為1 912090；福州新北，批號為19071812）動態濁度法鱟試劑回歸方程分別為lgT安=2.957-0.213 lgC安，r= -0.999 0；lgT福=2.939-0.205 lgC福，r= -0.996 0。結果陰性對照溶液反應時間均大于最低濃度標準曲線溶液反應時間，2 種鱟試劑所作標準曲線相關系數的絕對值均大于0.980，平行管之間變異系數均小于5%，表明細菌內毒素濃度在0.031 25～2.000 00 EU/mL 范圍內，其對數值與平均反應時間對數值的線性關系良好，細菌內毒素的標準曲線均成立。結果見表1。

表1 細菌內毒素標準曲線的可靠性試驗結果Tab.1 Reliability test results of the standard curves of bacterial endotoxin

2.4 干擾試驗

取3批（批號分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖無菌原料藥，各10 mg，精密稱定，分別放入去除熱原的研缽中，壓碎，研細，加入BET 用水2 mL，繼續研磨，直至香菇多糖溶散于BET 用水中，并呈透明、均勻溶液狀，轉移至試管中，用BET 用水稀釋至質量濃度為0.2 mg/mL 的溶液，備用。再用BET 用水將上述溶液稀釋至質量濃度分別為5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg/mL 的系列供試品溶液A；選擇靠近標準曲線中點的內毒素濃度（0.25 EU/mL）作為λm，制備與供試品溶液A 有相同稀釋倍數且含細菌內毒素濃度為λm（0.25 EU/ mL）的供試品溶液B；另以2.3 項下標準曲線溶液作陽性對照，記作溶液C，每個濃度平行3管；以BET用水作陰性對照，記作溶液D，平行2管。分別取供試品溶液A、供試品溶液B 各0.1 mL，加至預先加有0.1 mL 鱟試劑的細菌內毒素檢查反應板內，采用酶標儀測定，每個濃度重復2管。測定完成后，按標準曲線回歸方程分別計算供試品溶液A、供試品溶液B 的細菌內毒素含量Ct和Cs，并按公式R=（Cs-Ct）/λm×100%計算回收率。結果見表2。當供試品溶液A 的質量濃度為5.000 0 μg/mL時，部分供試品溶液B的回收率大于200%；當質量濃度分別為2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg / mL 時，供試品溶液B 的回收 率均在50%～200%范圍內，均符合要求。故質量濃度選擇2.500 0 μg/mL及以下進行樣品定量測定。

表2 干擾試驗結果Tab.2 Results of the interference test

2.5 研磨法處理樣品細菌內毒素回收率試驗［9-10］

樣品為難溶于水的大分子物質，在供試品溶液制備過程中，進行了分次物理研磨處理，為驗證研磨過程對細菌內毒素生物活性的影響，取細菌內毒素工作標準品1 支，加BET 用水溶解，按2.3 項下方法制備含細菌內毒素0.25 EU / mL 的溶液，備用，記為λm。分別取香菇多糖無菌原料藥（批號為Y1904101）10.12，10.10 mg，精密稱定，按2.4 項下方法分別制備溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，采用酶標儀測定，并繪制標準曲線，分別得回歸方程lgT安= 2.821 - 0.254 lgC安，r=- 0.999 6；lgT福= 2.883- 0.235 lgC福，r= - 0.999 0。計算樣品中細菌內毒素含量，并計算研磨法細菌內毒素的回收率。由表3 可知，當供試品溶液的質量濃度為0.312 5～5.000 0 μg/ mL 時，細菌內毒素回收率均在50%～200%范圍內；當質量濃度為2.500 0 μg/ mL 及以下時，細菌內毒素回收率均在80%～120%范圍內，均符合要求。故質量濃度選擇2.500 0 μg/mL進行樣品定量測定。

表3 研磨法回收率試驗結果Tab.3 Results of the recovery test by grinding method

2.6 樣品中細菌內毒素含量測定結果

取3批（批號分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖無菌原料藥各10 mg，精密稱定，分別用BET用水稀釋成質量濃度為2.500 0 μg/ mL 的供試品溶液。按2.3 項下方法制備標準曲線溶液和陰性對照溶液，標準曲線及相關系數為lgT= 2.911 - 0.203lgC，r= - 0.999 0。選擇0.25 EU/ mL 作為λm，同時制備含上述供試品質量濃度及細菌內毒素濃度為λm的供試品陽性對照溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至預先加有0.1 mL 鱟試劑的細菌內毒素檢查反應板內，采用酶標儀測定，每批樣品重復2管。結果見表4。

表4 樣品中細菌內毒素含量測定結果（安度斯）Tab.4 Results of content determination of bacterial endotoxin in samples（Zhanjiang A&C Biological Co.，Ltd.）

3 討論

細菌內毒素的檢查方法包括凝膠法和光度測定法［7］178-181，其中凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行細菌內毒素限度檢測的方法；光度測定法包括濁度法和顯色基質法，濁度法是利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而定量測定內毒素含量的方法。相比于傳統的凝膠法，動態濁度法具有操作方便、快捷、檢測范圍寬、靈敏度高等優點，當樣品中含有一定量的內毒素時，動態濁度法可以通過回收率判定樣品的干擾情況，方便試驗者對假陽性結果作出判斷［11］。

本研究中建立了定量檢測香菇多糖無菌原料藥中細菌內毒素的動態濁度法，當樣品質量濃度為0.312 5～2.500 0 μg/mL 時，對試驗無干擾作用，可選用質量濃度為2.500 0 μg/mL的供試品溶液進行定量測定。曾建立了檢測香菇多糖無菌原料藥中細菌內毒素的凝膠法［12］，與本檢測結果一致。

香菇多糖屬大分子化合物，難溶于水，可溶于熱水或稀堿。用熱水或稀堿處理樣品，會對細菌內毒素的生物活性產生影響。溫度低于70 ℃，內毒素分子的破壞程度與時間呈正比［13］；堿溶液對細菌內毒素也有一定破壞作用，且實際操作中，堿溶解樣品后，需要用酸回調溶液的pH 值至合適范圍內［14］，操作煩瑣。本研究中采用物理研磨法增加了香菇多糖無菌原料藥的溶解性，以提升樣品的溶解速度，操作簡便，且3 批香菇多糖無菌原料藥的細菌內毒素回收率均接近100%，表明物理研磨法對細菌內毒素的生物活性無影響。

動態濁度法檢測細菌內毒素在生產與臨床上有良好的應用前景。反應曲線可直觀顯示反應過程，快速、準確測定樣品中的內毒素含量，并考察樣品受干擾情況，有利于在生產過程中實時監控無菌原料藥的污染情況，降低生產風險［15］。由于單位時間內人體僅可承受一定限值的細菌內毒素，多種藥物中細菌內毒素疊加，如超過限值，會導致危險［16］。而本品為癌癥輔助治療藥物，與其他藥物聯用時，動態濁度法能準確、快速測定各藥品中細菌內毒素的量值，可作為臨床聯合用藥的參考。