造血干細胞移植治療對再生障礙性貧血患者外周血Treg 細胞及TGF-α、G-CSF 水平的影響

周航，賈冉，黃金

（南陽市中心醫院血液內科，河南 南陽473000）

再生障礙性貧血是由于多因素作用引發的一種非惡性血液病，患者會出現造血功能損傷、外周血全血細胞減少、貧血等情況。 目前，造血干細胞移植治療仍是臨床用于徹底治愈再生障礙性貧血的最有效的方法之一[1-2]。 骨髓干細胞有高度自我更新、分化的能力，可分化為各血細胞系統的祖細胞， 且造血能力極強， 可達到正常造血情況的9倍， 因此， 用于治療再生障礙性貧血有很好的療效。 臍帶血造血干細胞和骨髓造血干細胞移植均是臨床常用的干細胞移植治療再生障礙性貧血的方法[4-5]。 有研究顯示，臍帶血中含有多種有益的細胞，如調節性T 細胞等。 臍帶血造血干細胞分化潛能極高，增殖能力優于骨髓造血干細，且取材更加方便。 因此，臍帶血造血干細胞治療再生障礙性貧血的應用逐漸廣泛[6]。 再生障礙性貧血患者常見免疫功能紊亂，T 細胞亞群出現異常， 對患者外周血調節性T 細胞（regulatory Tcell，Treg）細胞以及多種細胞因子的觀察具有明顯意義[7]。 本研究探討了造血干細胞移植治療對再生障礙性貧血患者外周血Treg 細胞及轉化生長因子 （transforming growth factor-α，TGF-α）、 粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）水平的影響，為提高再生障礙性貧血治療療效提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年2 月至2020 年2 月我院確診的再生障礙性貧血患者且接受非血緣造血干細胞移植治療患者70 例，男39 例，女31 例，年齡20～65 歲，平均年齡（41.65±19.74）歲。 納入標準：（1）符合《再生障礙性貧血的診斷和治療指南》[8]中的再生障礙性貧血診斷標準；（2）經骨髓穿刺、活檢等確診為再生障礙性貧血；（3）經家屬和患者知情同意；（4）醫院倫理委員會通過。 排除標準：（1）存在嚴重感染或出血情況且病情不可控制的患者；（2）存在其他血液疾病的患者；（3）嚴重高血壓、心臟病以及合并惡性腫瘤患者。 患者中接受非血緣臍帶血造血干細胞移植患者33 例作為觀察組，男20 例，女13 例，年齡20～65 歲，平均年齡（41.33±19.02）歲。 接受非血緣骨髓造血干細胞移植37 例作為對照組，男19 例，女18 例，年齡20～65 歲，平均年齡（41.93±19.94）歲。 兩組患者性別、年齡等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 治療方法 預處理方案：根據患者個體特異性選擇與處理方案。 方案一： 采用環磷酰胺50 mg（kg·d）；抗人胸腺球蛋白20 mg（kg·d），均使用4 d，靜脈滴入。 方案二：口服馬利蘭5 mg（kg·d），3 d；靜脈滴入Cy 1.8 g( m2·d) ，3 d；靜脈滴入阿糖胞苷2 g ( m2·d) ，使用時間為20 h。

觀察組患者接受非血緣臍帶血造血干細胞移植治療。 根據凍存前臍血（北京臍血庫）有核細胞數和CD34+細胞數及患者個體情況選擇臍血，經鎖骨下中心靜脈或骨髓腔注入治療。 臍血總有核細胞數中位值為4.11（1.94～16.25）×10／kg，其中CD34+細胞中位值為2.69（0.68～29.26）×10／kg。33 例患者中，單份臍血移植18 例，雙份臍血移植15 例。 單份臍血的總有核細胞數中位值為4.31 （2.39～16.23）×10／kg； 總CD34+細 胞 數 中 位 值 為2.88（0.67～29.27）×10／kg。 雙份臍血的總有核細胞數中位值為4.45（2.74～7.68）×10／kg ；總CD34+細胞數中位值為2.65（0.74～9.48）×10／kg。

對照組患者接受非血緣骨髓造血干細胞移植治療。 供者注射重組人粒細胞 集落刺激因子5 μg（kg·d），使用時間為5 d。 第4 d 進行骨髓采集，有核細胞數要求達4×108/kg， 并回輸循環采集自體血。2 d 后，采集外周血干細胞，總量10L，總單個核細胞數達4×108/kg。 采用流式細胞儀（常州必達科生物科技有限公司） 計數采集物中CD3+、CD4+、CD8+、CD34+細胞。 采集物均即刻進行患者回輸。

1.3 觀察指標

1.3.1 兩組患者的臨床療效比較 患者的臨床療效評定參照《血液病診斷及療效標準》[9]判斷臨床療效。患者3 個月內不需輸血，1 年內未復發，貧血和出血情況基本恢復正常，男性患者血紅蛋白達120 g/L、女性患者血紅蛋白達110 g /L；患者白細胞水平達4×109/L，血小板水平達100×109/L 為痊愈。 患者貧血和出血癥狀基本消失， 男性患者血紅蛋白水平達120 g/L， 女性患者血紅蛋白水平達100 g/L，白細胞水平達3.5×109/L，血小板有所增加，3 個月內病情較穩定，不需輸血，無惡化趨勢為顯效。患者貧血和出血癥狀明顯好轉，不需輸血，血紅蛋白三個月內水平較治療前常見值改善保持30 g/L以上為有效。 患者治療后，各項臨床癥狀以及血紅蛋白水平、 血小板水平等均無改善甚至惡化為無效。

1.3.2 兩組患者外周血Treg、Th17 細胞情況比較取患者治療前后空腹靜脈外周血5 mL， 加入紅細胞裂解液1 mL，利用流式染色緩沖液清洗1 次；預冷70%乙醇固定，4 ℃條件下避光60 min，PBS 清洗2 次；加入熒光標記抗體，在4℃條件下，孵育30 min 后， 以流式染色緩沖液清洗2 次。 每管獲取30000 個細胞，利用流式細胞儀（常州必達科生物科技有限公司） 測定Th17、Treg 并對Treg/Th17 進行計算。

1.3.3 血清細胞因子水平 取患者治療前后空腹靜脈血5 mL，靜置30 min，3 000 r/min 離心，分離血清，利用酶聯免疫試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）測定TGF-α、INF-α，G-CSF，嚴格按照說明書進行操作。

1.3.4 兩組患者并發癥發生情況 治療后1 年內，對患者進行隨訪調查，記錄兩組患者治療后感染、出血、頭暈、排異反應等并發癥發生情況。 觀察組和對照組各有兩名患者隨訪失敗。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析， 滿足正態分布且方差齊的計量資料采用（±s）表示，采用兩樣本獨立t 檢驗比較組間差異，計數資料用率%表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床療效比較 觀察組治療的有效率為90.91%，與對照組的有效率（83.78%）無明顯差異（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者的臨床療效比較（n，%）

2.2 兩組患者外周血Treg、Th17 細胞情況比較 治療后，兩組患者外周血Treg、Treg/Th17 水平較治療前明顯上升，Th17 水平明顯下降（P＜0.05），且觀察組患者外周血Treg、Treg/Th17 水平明顯高于對照組，Th17 水平明顯低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者外周血Treg、Th17 細胞情況比較（±s）

表2 兩組患者外周血Treg、Th17 細胞情況比較（±s）

注：與治療前相比，*P＜0.05。

組別 n Treg（%）治療前 治療后Th17（%）治療前 治療后Treg/Th17治療前 治療后對照組觀察組t P 37 33 2.20±1.35 2.45±1.58 0.731 0.466 2.91±1.61*3.83±1.87*2.211 0.030 3.48±1.48 3.36±1.52 0.334 0.739 2.73±1.05*2.08±0.83*2.849 0.005 0.59±0.13 0.54±0.17 1.390 0.168 1.01±0.75*1.94±1.07*4.246＜0.001

2.3 兩組患者血清細胞因子水平比較 治療后，兩組患者TGF-α、INF-α 水平較治療前明顯下降，GCSF 水平明顯上升（P＜0.05），且觀察組患者TGFα、INF-α 水平明顯低于對照組，G-CSF 水平明顯高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者兩組患者血清細胞因子水平比較（±s）

表3 兩組患者兩組患者血清細胞因子水平比較（±s）

注：與治療前相比，*P＜0.05。

組別 n TGF-α（μg/L）治療前 治療后G-CSF（pg/mL）治療前 治療后INF-α（pg/mL）治療前 治療后對照組觀察組t P 37 33 24.39±3.39 25.16±3.36 0.952 0.344 20.89±2.69*16.63±2.28*7.101＜0.001 7.93±0.72 7.86±0.79 0.387 0.699 12.39±3.03*25.62±3.39*17.243＜0.001 29.63±3.36 28.89±3.30 0.927 0.356 14.36±1.45*11.75±0.63*9.560＜0.001

2.4 兩組患者的并發癥發生情況比較 觀察組與對照組患者并發癥發生情況差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 兩組患者的并發癥發生情況比較（n，%）

3 討論

再生障礙性貧血發展嚴重可導致骨髓造血衰竭，且疾病感染發生率高，常伴隨臟器出血，感染和出血已成為患者常見死因[10]。造血干細胞不僅具有極強的自我自我復制能力且幾乎可以分化為所有類型的血細胞， 并經血流遷移到外周血液循環中， 因此造血干細胞移植是治療再生障礙性貧血最有效的方法之一。 本研究結果顯示，觀察組治療的有效率為90.91%，與對照組的有效率（83.78%）無明顯差異。 說明兩種造血干細胞移植方式治療再生障礙性貧血均有顯著效果。

本研究結果顯示， 治療后， 兩組患者外周血Treg、Treg/Th17 水平較治療前明顯上升，Th17 水平明顯下降，且觀察組患者外周血Treg、Treg/Th17 水平明顯高于對照組，Th17 水平明顯低于對照組。既往研究顯示， 再生障礙性貧血的發生與患者自身免疫性系統發生異常有關[11-13]。 外周血Treg 與Th17 細胞作為重要的免疫細胞， 其水平影響著再生障礙性貧血等血液病中的治療和恢復[14]。再生障礙性貧血患者體內，Treg 細胞水平降低，會抑制免疫耐受調節功能，使效應T 細胞發生異常增殖。 再生障礙性貧血患者治療后，體內Th17 細胞比例會明顯減低，與Treg 細胞水平呈負相關[15-16]。目前，已有相關研究證實， 臍血造血干細胞移植成功率較高，移植反應弱，對免疫系統調節效果好[17]。結合本研究說明， 接受造血干細胞移植治療可以明顯改善患者外周血Treg、Th17 情況，造血干細胞移植治療可以有效改善機體的免疫調節功能， 且臍帶血造血干細胞移植治療效果優于血緣骨髓造血干細胞移植治療。

治療后，兩組患者TGF-α、INF-α 水平較治療前明顯下降，G-CSF 水平明顯上升，且觀察組患者TGF-α、INF-α 水平明顯低于對照組，G-CSF 水平明顯高于對照組。 既往研究顯示，TGF-α 是一種多肽生長因子，可由血小板、巨噬細胞以及淋巴細胞等分泌，TGF-α 與多種癌細胞的增殖以及細胞損傷有關[18]。 IFN 是由T 淋巴細胞和自然殺傷細胞分泌的免疫介導因子， 骨髓基質中的IFN-α 分泌紊亂會使造血前體細胞功能異常， 導致造血干細胞凋亡， 再生障礙性貧血與IFN-α 分泌增加息息相關[19-21]。G-GSF 是一種造血生長因子，臨床常用GGSF 治療白細胞減少以及多種骨髓造血機能障礙等，G-GSF 可以促進中性粒細胞系造血細胞的增殖、分化，G-CSF 水平上升，代表造血功能有所恢復[22]。 結合本研究結果說明，造血干細胞移植治療可以明顯改善細胞損傷，恢復骨髓造血機能，明顯改善再生障礙性貧血， 且且臍帶血造血干細胞移植效果優于血緣骨髓造血干細胞移植治療。 觀察組與對照組患者并發癥發生情況無明顯差異。 說明兩種造血干細胞移植方法安全性相近。

綜上所述， 臍帶血造血干細胞移植和骨髓造血干細胞移植治療再生障礙性貧血均有很好的療效， 臍帶血造血干細胞移植治療對改善Treg 細胞水平，調節免疫反應，恢復造血功能效果更顯著。