TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清中的表達(dá)及診斷價(jià)值

王迪，徐云，劉北彥，孟祥雨，白立煒，陳雪輝

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科一病區(qū)，河南 衛(wèi)輝453100）

2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥是指糖尿病并發(fā)骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨脆性增加的全身代謝性骨病，嚴(yán)重威脅人類生命健康。 2 型糖尿病導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚未明確， 可能與糖尿病出現(xiàn)的高血糖、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[1]。 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是重要的炎癥介質(zhì)，可增加血管通透性，刺激血管細(xì)胞增殖。 研究顯示，TNF-α 與骨代謝密度相關(guān)，可能參與骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是一類小分子非編碼RNA，參與調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化等骨代謝相關(guān)信號(hào)通路， 在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5]。 同源盒轉(zhuǎn)錄因子6 反義RNA 1（Distal-less homeobox 6 antisense RNA 1，DLX6-AS1）是一種lnc RNA，位于人類7 號(hào)染色體。研究顯示，lnc RNA DLX6-AS1 在糖尿病腎病患者血清中表達(dá)升高， 其表達(dá)升高可能通過損傷足細(xì)胞介導(dǎo)糖尿病患者腎功能降低[6]。 目前，還未見lnc RNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。 本研究主要探討了TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清中的表達(dá)水平， 并分析了其對(duì)該疾病的診斷價(jià)值， 以期為該疾病的診斷提供新的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年4 月至2018 年12 月于本院就診的126 例2 型糖尿病患者為研究對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1999 年WHO 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝腎功能正常，無(wú)其他糖尿病并發(fā)癥；（2）未接受任何糖尿病治療；（3）無(wú)長(zhǎng)期大量飲酒史。 根據(jù)骨密度測(cè)定結(jié)果分為單純2 型糖尿病組 （72 例） 和2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組（54例）。 單純2 型糖尿病組男性32 例，女性40 例，平均年齡（56.38±7.54）歲。 2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組男性25 例， 女性29 例， 平均年齡 （58.49±7.85）歲。另選取同時(shí)期60 例健康體檢者作為對(duì)照組，男性26 例，女性34 例，平均年齡（57.64±7.29）歲。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，且患者自愿簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) 所有受試者測(cè)量身高和體重，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI），BMI=體重/身高2（kg/m2）。 采集清晨空腹靜脈血5 mL，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、 高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），放射法測(cè)定空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，DCA2000+糖化血紅蛋白測(cè)定儀 （德國(guó)拜爾公司）測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（FBG×FINS）/22.5[7]。

1.3 骨密度測(cè)定 采用雙能X 線骨密度儀 （美國(guó)GEPRODIGY 公司）測(cè)正位脊柱第2～4 腰椎、股骨頸、 大轉(zhuǎn)子、 小轉(zhuǎn)子、Ward 三角的骨密度（bone mineral density，BMD），以g·cm2表示。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清TNF-α 水平 患者空腹靜脈血置于抗凝管中，3500 r/min 離心10 min。 取上清， 參照TNF-α 試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α 水平。 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 檢測(cè)血清lncRNA DLX6-AS1 表達(dá)水平 Trizol 試劑提取血清中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA 的濃度和純度后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒。然后以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增程序：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃60 s， 共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。 引物序列：lncRNA DLX6-AS1 上游5′-CCACCCACTGAGAGAAGAGG-3′，下游5′-CCT CCAAGCAATTGTCCAGT-3′；GAPDH 上游5′-CGGAACGTGCCGTAGCTGAAA-3′， 下 游5′-GCCTGACAAGTGAATCTAC G-3′。 以GAPDH 為內(nèi)參，2－△△Ct法 計(jì) 算lncRNA DLX6-AS1 的 相 對(duì) 表 達(dá) 水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。 Pearson相關(guān)性分析2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性，受試者工作特征（ROC）曲線分析TNFα 和lncRNA DLX6-AS1 對(duì)2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的診斷價(jià)值，Logistic 回歸分析2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的影響因素。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 健康對(duì)照組、單純2 型糖尿病組和2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組患者性別、年齡、BMI 及血清TC、LDL-C 和HDL-C 兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與健康對(duì)照組比較，單純2 型糖尿病組和2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組患者血清TG、HbA1c、FBG、FINS 和HOMA-IR 升高（P＜0.05），BMD 降低（P＜0.05）。 單純2 型糖尿病組比較，2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組患者血清TG、HbA1c、FBG、FINS 和HOMA-IR 比 較 差 異 均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BMD 降低（P＜0.05）。見表1。

表1 三組患者一般資料比較

2.2 三組患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平 與健康對(duì)照組比較，單純2 型糖尿病組和2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。與單純2 型糖尿病組比較，2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥組患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。 見圖1、表2。

表2 三組患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表達(dá)水平

圖1 lncRNA DLX6-AS1 的PCR 擴(kuò)增曲線

2.3 2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析 2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 與FBG、FINS 和HOMA-IR 均呈正相關(guān)（P＜0.05），與BMD 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。 見表3。

表3 血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 診 斷 價(jià) 值 與TNF-α 或lncRNA DLX6-AS1 單獨(dú)診斷比較， 二者聯(lián)合檢測(cè)診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的靈敏度、 特異度及準(zhǔn)確度升高（P＜0.05）。 見圖2、表4。

表4 TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的價(jià)值

圖2 TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的ROC 曲線

2.5 Logistic 回歸分析 Logistic 回歸分析顯示，lncRNA DLX6-AS1 是2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。 見表5。

表5 Logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

2 型糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的代謝疾病。 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)及人民生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[8]。 糖尿病患者骨質(zhì)疏松發(fā)病率及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加， 嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。 目前，糖尿病骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因尚不明確。 探討糖尿病骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)異常表達(dá)的因子可為疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及診斷和治療提供新思路。

正常骨代謝的主要形式是骨重建， 當(dāng)骨吸收增加、骨轉(zhuǎn)換降低時(shí)可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[9]。 TNF-α 是重要的炎性介質(zhì)， 參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、 炎癥等過程，其大量產(chǎn)生和釋放會(huì)破壞機(jī)體免疫平衡[10]。 有報(bào)道稱，TNF-α 可抑制成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原，誘導(dǎo)骨原細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6 等炎性介質(zhì)，促進(jìn)破骨細(xì)胞生長(zhǎng)，加速骨吸收[11]。本研究顯示，單純2 型糖尿病患者血清TNF-α 表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，而2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清TNF-α 表達(dá)水平高于單純2 型糖尿病患者， 與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[12]，提示TNF-α 與2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 骨骼肌中炎性因子的增加與機(jī)體糖代謝紊亂相關(guān)，TNF-α 是第一個(gè)被證實(shí)與胰島素抵抗相關(guān)的炎癥因子， 骨骼肌分泌的TNF-α 與葡萄糖的攝取和利用呈負(fù)相關(guān)[13]。 本研究顯示，TNF-α 表達(dá)與骨密度呈負(fù)相關(guān)，與FBG、FINS 和HOMA-IR 均呈正相關(guān)，提示TNF-α表達(dá)升高可能使糖尿病患者骨密度降低， 增加骨質(zhì)增殖發(fā)生概率。 血清TNF-α 單獨(dú)診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的靈敏度、特異度、及準(zhǔn)確度分別為64.81%、60.00%、62.28%和，單獨(dú)診斷的價(jià)值不高，可能會(huì)造成漏診。

lnc RNA DLX6-AS1 屬于自然反義RNA，可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相應(yīng)的正義mRNA，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。 研究顯示，lnc RNA DLX6-AS1在甲狀腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)升高，沉默其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[14-17]。 目前，lnc RNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者中的表達(dá)及意義還未知。 本研究顯示，2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清lnc RNA DLX6-AS1 表達(dá)水平均高于單純2 型糖尿病患者和健康對(duì)照患者，其表達(dá)升高是影響該疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示lnc RNA DLX6-AS1 可能參與2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。 本研究還顯示，lnc RNA DLX6-AS1 與骨密度呈負(fù)相關(guān)，其診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的靈敏度、 特異度及準(zhǔn)確度分別為77.78%、75.00%、76.31%，說明lnc RNA DLX6-AS1 對(duì)該疾病具有較高的診斷價(jià)值。 聯(lián)合檢測(cè)TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 時(shí)， 診斷2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的靈敏度、 特異度及準(zhǔn)確度分別為92.59%、90.00%、91.23%，均高于二者單獨(dú)檢測(cè)，提示聯(lián)合檢測(cè)血清TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 水平對(duì)于2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的診斷價(jià)值較高。

綜上所述，TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者血清中表達(dá)升高，監(jiān)測(cè)血清TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 表達(dá)變化有助于評(píng)價(jià)該疾病的發(fā)展情況。 但本研究樣本量較少，可能存在一定誤差，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步說明二者與可能2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性，以期為該疾病的診斷提供新思路。