鮑曼不動(dòng)桿菌Hcp 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化

胡音音，杜偉鵬，張亞東，盧慶文，李向陽

（1.南陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 南陽473009；2.南陽市中心醫(yī)院肝臟外科，河南 南陽473009；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州325027）

隨著鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離率的不斷攀升及多重耐藥和泛耐藥菌株的不斷涌現(xiàn)， 該菌的感染已成為國內(nèi)乃至世界面臨的一大公共衛(wèi)生問題。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type ⅥSecretion System, T6SS）是存在于大多數(shù)革蘭陰性桿菌中的一種新型分泌系統(tǒng)， 對其功能研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)不僅參與細(xì)菌間的種群競爭作用，具有殺傷異種菌功能，還與細(xì)菌毒力相關(guān)[1-2]。 作為T6SS 的核心組分，溶血素共調(diào)節(jié)蛋白（Hemolysin-coregulated protein，Hcp）的 檢 測是驗(yàn)證T6SS 活性最重要的方法，因此其單克隆抗體的制備顯的尤為重要。 另外，Hcp 蛋白家族本身又是一種效應(yīng)因子，參與細(xì)菌的致病過程[3]，但其在鮑曼不動(dòng)桿菌致病性中的研究甚少。 本研究擬構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌Hcp 原核表達(dá)載體， 探索蛋白表達(dá)情況并純化Hcp 蛋白，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a(+)質(zhì)粒、ATCC17978 標(biāo)準(zhǔn)菌株和E.coli BL21(DE3)菌株為本實(shí)驗(yàn)室自存。pJET1.2克隆載體和CloneJET PCR Cloning 試劑盒購于美國Thermo 公司，IPTG、卡那霉素及質(zhì)粒提取、DNA回收、PCR 產(chǎn)物純化的試劑盒均購于上海捷瑞生物有限公司，T4 DNA Ligase、Xho Ⅰ和Nco Ⅰ內(nèi)切酶購于大連寶生生物有限公司，細(xì)菌DNA 提取試劑盒、His 蛋白純化試劑盒、鼠抗-His 多克隆抗體、羊抗鼠IgG（HRP 標(biāo)記）、蛋白酶抑制劑（PMSF）均購于碧云天上海生物有限公司， PVDF 膜、蛋白超濾管等購于美國Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 Hcp 基因擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 采用DNA 提取試劑盒提取ATCC17978 菌株全基因組DNA，根據(jù)Hcp 基因序列，參照pET-28a (+)質(zhì)粒的限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成一對帶有Xho Ⅰ和Nco Ⅰ位點(diǎn)的特 異性引物。 引 物 序 列 如 下：F: 5’—GCATCCATGGATGAAAGATATATACGTTGA—3’,R:5’—CCGCT CGAGCGCTGCGTAAGAAGCTGTAT—3’（黑體示酶切位點(diǎn)）。 Hcp 基因擴(kuò)增通過PCR 技術(shù)完成，反應(yīng)條件為：94℃10 min；94℃40 s，50℃30 s，72℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收并純化備用。

1.2.2 pET-28a (+)-Hcp 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)CloneJET PCR Cloning 試劑盒說明書將Pjet1.2 平末端載體與Hcp 基因純化物連接， 隨后立即轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建Pjet1.2-Hcp 克隆載體轉(zhuǎn)化株并驗(yàn)證。用Nco I 和Xho Ⅰ對pET-28a(+)和Pjet1.2-Hcp 進(jìn)行酶切，回收有切口的pET-28a(+)和Hcp 基因片段，將兩者以3～5:1（摩爾比）的比例在16℃環(huán)境下連接16 h。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)種LB 固體培養(yǎng)基（用卡那霉素進(jìn)行篩選），挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR 鑒定、酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 Hcp 的誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)方式的探索及western blot 驗(yàn)證 將導(dǎo)入pET-28a (+)-Hcp 重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)（后面簡稱“重組菌”）轉(zhuǎn)種含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃，250 rpm 培養(yǎng)過夜，次日取適量菌液再次轉(zhuǎn)種， 同樣條件培養(yǎng)至OD600≈0.5。 取出2 mL 菌液作對照樣品，剩余菌液加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導(dǎo)，于相同條件下培養(yǎng)5h（作為對照，導(dǎo)入pET-28a(+)的E.coli BL21(DE3)也同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)處理），取適量誘導(dǎo)后的菌液備用。 剩下的菌液用超聲裂解處理分離沉淀和上清。 取誘導(dǎo)前后的菌液、 空載體誘導(dǎo)菌液100℃煮沸裂解及超聲裂解的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE 電泳， 并用western blot 驗(yàn)證目的蛋白。

1.2.4 探索IPTG 誘導(dǎo)Hcp 表達(dá)的濃度和時(shí)間 取適量過夜培養(yǎng)的重組菌轉(zhuǎn)種LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600≈0.5，以不同終濃度的IPTG（0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L 和1.0 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)5 h 或以終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG 分別誘導(dǎo)表達(dá)3 h、5 h、7 h、9 h、10 h。離心收集并處理菌體，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析結(jié)果。

1.2.5 大量表達(dá)Hcp 重組蛋白、分析表達(dá)方式及純化 將重組菌轉(zhuǎn)種大量LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600≈0.5，以最佳的IPTG 濃度誘導(dǎo)5~7 h，離心收集菌體。加入含PMSF 的超聲裂解液及終濃度為1 mg/mL 的溶菌酶重懸菌體，于冰上超聲裂解重懸菌， 分離上清和沉淀。 上清和沉淀均進(jìn)行SDSPAGE 電泳以分析重組蛋白的存在形式。純化重組蛋白據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。 純化蛋白液用10 KD的超濾管濃縮，經(jīng)0.22 μm 濾菌器除菌后分裝、保存。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增Hcp 基因及PCR 產(chǎn)物純化 擴(kuò)增Hcp 基因并純化后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳， 獲得約500 bp 的基因擴(kuò)增物，與預(yù)期大小一致，見圖1。

圖1 Hcp 基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a (+)-Hcp 的構(gòu)建及鑒定pET-28a (+) 和Hcp 基因連接后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3）并轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基，選取數(shù)個(gè)菌落行Hcp 基因擴(kuò)增，如圖2 所示，菌落1、4、6 為陽性，菌落2、3、5為陰性。 提取1、4、6 菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳顯示出預(yù)期約500 bp 的目的基因，見圖3。

圖2 菌落PCR 鑒定結(jié)果

圖3 pET-28a(+)-hcp 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

將上述1、4、6 號菌送上海桑尼生物技術(shù)有限公司對Hcp 基因序列測序， 對結(jié)果進(jìn)行比對，與GenBank （CP012004.1）：ACX60_11670 相 似 率 達(dá)100%。 具體序列如下：GGTACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT ACCATGGATGAAAGATATATACGTTGAGTTTCGC GGTAAATATAAAGTTGATGGAGAATCTCGTGATT CTGAGCACAAAGGTTGGTTAGAAGTTAACTCTTG GTCTCATAACATCCGTCAACCTAAATCTGCTACTT CAAGTAGTGTAGGCGGCCACACTGCTGAACGTGT TGAACATTCTGACATGGTTTTCGTAAAAGACTTA GATGCAACTAGCCCTAAATTATGGGAAGCTTGTT CAGCTGGTTATACATTTGATGAAGTACAAATCGA CTTCTATCGTGCAAATGGCGATAAACGTATCAAG TACTTACAAATCAAATTGAAGCACGTTTTAGTTTC TAGTGTGACTCCAACTGTTAACGAAGAAGGCGTT CCTACAGAAGCATTCGGTTTGAAATATGCTGCTG TTGAGTGGACTTATAACCAACAAGATATTAACGG TACTGCTAAAGGTGCTGTTACTAAGAAATGGTCA CTTTCTAATAATACAGCTTCTTACGCAGCGCTCGA GCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCT AACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCT GCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCT GAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGG GACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCG GGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC TTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTC TTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCC CCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGG TTCCGATTTAGTGCTTTACCGGCACCTC

2.3 Hcp 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將誘導(dǎo)后的pET-28a(+)導(dǎo)入菌、誘導(dǎo)前后的重組菌煮沸裂解物及重組菌誘導(dǎo)后的超聲破菌上清和沉淀同時(shí)上樣。如圖4所示， 重組菌誘導(dǎo)后的煮沸裂解物和超聲裂解的上清和沉淀均高表達(dá)19KD 的蛋白，而空載體菌和誘導(dǎo)前重組菌則不表達(dá)或低表達(dá)。

圖4 Hcp 蛋白在E.coli BL21 中的表達(dá)

2.4 IPTG 誘導(dǎo)Hcp 表達(dá)的最佳濃度和時(shí)間 如圖5A 所示，Hcp 蛋白在0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量最高。如圖5B 所示，Hcp 蛋白在誘導(dǎo)5~7 h 后后表達(dá)量最高。

圖5 不同IPTG 誘導(dǎo)濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間下Hcp 蛋白的表達(dá)情況

2.5 蛋白純化及鑒定 本實(shí)驗(yàn)使用重組菌超聲裂解的上清液進(jìn)行重組蛋白的純化，作為陰性對照，pET-28a(+)導(dǎo)入菌破菌上清也同時(shí)同步進(jìn)行純化，純化過程中預(yù)留洗滌液、穿流液、洗脫液等驗(yàn)證純化效果。 電泳顯示上清液純化的洗脫液中僅在19 kD 左右處出現(xiàn)蛋白條帶，見圖6A。 而pET-28a(+)導(dǎo)入菌破菌上清純化物中無任何蛋白，見圖6B。通過Western blot 進(jìn)一步鑒定， 蛋白純化物能與His抗體結(jié)合，見圖6C。

圖6 Hcp 蛋白純化及Western blot 鑒定

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種主要引起醫(yī)院內(nèi)感染的革蘭陰性菌。 隨著近年來多重耐藥、泛耐藥和高毒力株的出現(xiàn)， 使該菌引起的感染有著高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[4-5]，因此世界衛(wèi)生組織已將碳青霉烯耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌列為急需新型抗生素的重點(diǎn)病原體， 廣大科研工作者也一直致力于該菌耐藥機(jī)制和致病機(jī)制的研究。

在鮑曼不動(dòng)桿菌中，Hcp 不僅是T6SS 的核心蛋白，其本身也是一種效應(yīng)因子，該蛋白常被分泌到細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液、 感染者的痰液甚至血清中，標(biāo)志著T6SS 處于活性狀態(tài)（T6SS+）[6-8]。 因此，大多數(shù)科研工作者研究革蘭陰性菌T6SS 時(shí)的必需首要工作就是制備Hcp 蛋白[1,3,6,9]。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)典的基因克隆的方法制備了Hcp 原核表達(dá)載體并通過測序的方法驗(yàn)證了重組質(zhì)粒中Hcp 序列未發(fā)生突變。 SDS-PAGE 電泳顯示重組菌在IPTG 誘導(dǎo)后可大量表達(dá)預(yù)期大小的蛋白，Western Blot 驗(yàn)證了在原核細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白就是Hcp 重組蛋白。此外，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究表明，重組菌在0.5 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)5~7 h 的條件下蛋白表達(dá)量最高，且目的蛋白在破菌沉淀和上清中的含量相差無異，這為該領(lǐng)域的研究者提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。 在蛋白純化上， 本實(shí)驗(yàn)選用破菌上清進(jìn)行目的蛋白的非變性純化， 同時(shí)空載體導(dǎo)入菌也進(jìn)行同樣的操作及純化，既可驗(yàn)證操作過程的可靠性，又為Hcp 融合蛋白功能的研究提供了對照物。

T6SS 在革蘭陰性菌的生存和致病中發(fā)揮重要作用[10-12]，比如，Hcp 蛋白在洋蔥伯克霍爾德菌和鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用[1,13]；E.coli K1 引起人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞凋亡等方面都有Hcp蛋白家族的參與[3]；此外，有研究發(fā)現(xiàn)T6SS 的負(fù)向調(diào)節(jié)因子存在于鮑曼不動(dòng)桿菌內(nèi)的耐藥性質(zhì)粒上[14]，這說明T6SS 與該菌的耐藥性也有極大的關(guān)聯(lián)。綜上，研究鮑曼不動(dòng)桿菌的T6SS 有望在其致病機(jī)制和耐藥機(jī)制方面得到新突破。 前期，本團(tuán)隊(duì)從基因?qū)用姘l(fā)現(xiàn)Hcp 在感染狀態(tài)的鮑曼不動(dòng)桿菌中的表達(dá)量較定植狀態(tài)突出，并且其RNA 水平的表達(dá)受到免疫細(xì)胞、感染狀態(tài)和pH 的調(diào)節(jié)[15]，但其蛋白層面的研究并未涉及。Hcp 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建為上述研究、 去定植研究及疫苗研究等后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。