重度再生障礙性貧血患者外周血IL-2、IL-18、CD34+細胞表達及其預后相關性

高慧，何婷婷，高玲

（1.河南科技大學第一附屬醫院檢驗科，河南 洛陽471000；2.洛陽市第五人民醫院精神一科，河南 洛陽471000；3.河南省腫瘤醫院婦瘤科，河南 鄭州450000）

再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）是一種以骨髓造血干細胞增生能力低下、 外周血全血細胞減少為主的獲得性骨髓造血功能衰竭性疾病[1-2]。AA 可分為遺傳和獲得性兩類， 又可分為重型AA（SAA）和非重型AA（NSAA）。 SAA 病情進展迅速，預后兇險，其發病機制尚不明確，有學者認為與細胞免疫異常有關， 細胞免疫異常可引發造血功能衰竭，另外Th1 細胞過度表達時可導致AA 發生[3]。白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是T 細胞炎癥的誘導因子，可通過刺激Th1 細胞過度表達，導致免疫紊亂[4]。 有研究顯示，外周血T 淋巴細胞被異常活化后，可產生抑制造血的細胞因子，如白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）等[5]。 造血干細胞是各種血細胞和免疫細胞的起始細胞， 具有多向分化和自我復制的能力[6]。 正常情況下，機體內造血干細胞的多向分化能力和自我復制能力是處于動態平衡的，一旦平衡被打破，機體的造血系統將發生嚴重的疾病[7]。 CD34+抗原是造血干細胞表面的糖蛋白，當機體造血功能出現損壞時，可導致骨髓中CD34+細胞向外周血遷移[8]。 目前有關IL-2、IL-18 和CD34+細胞表達與SAA 患者的預后關系的報道較少， 本研究擬探討三者對SAA 患者的預后評估價值，旨在為預估患者預后，及時調整治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年1 月至2018 年1 月本院收治的SAA 患者60 例為研究對象（SAA 組），男32 例， 女28 例， 年齡15~55 歲， 平均年齡（37.85±9.72）歲。 納入標準：（1）符合《血液病診斷及療效標準》中SAA 的診斷標準，屬于獲得性AA[9]；（2）入院后經骨髓涂片、骨髓活檢等檢查確診；（3）患者/患者家屬了解本次研究， 且已簽署同意書；（4）隨訪時間＞6 個月。排除標準：（1）患有自身免疫性疾病；（2）患有感染類疾病；（3）合并嚴重心、肝、腎功能障礙疾病。 選擇同期在本院體檢的健康者60 例為對照組，男30 例，女30 例，年齡15~60 歲，平均年齡（42.18±11.65）歲。 患者及家屬同意簽署知情同意書和臨床研究協議書， 本研究通過本院倫理委員會批準，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑及儀器 IL-2 ELISA 試劑盒（貨號：SEA073Bo02）、IL-18 ELISA 試 劑 盒 （貨 號：SCA064Hu02）， 購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；FACSCalibur 流式細胞儀，購自美國BD 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 對所有研究對象清晨空腹時采取靜脈血5~6 mL 裝于含乙二胺四乙酸（EDTA）采血管中，平均分成兩份，一份4℃，4000 r/min，離心8 min，留上清，凍存于-80℃冰箱中，待測；另一份直接凍存于-80℃冰箱中，待測。

1.3.2 檢測血清中IL-2、IL-18 水平 采用酶聯免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清中IL-2、IL-18 水平， 操作步驟嚴格依據IL-2 ELISA 試劑盒、IL-18 ELISA 試劑盒進行。IL-2 參考范圍為5~15 pg/mL，IL-18 參考范圍為5~ 200 ng/L。

1.3.3 CD34+細胞檢測 檢測所有研究對象外周血中CD34+細胞百分比。取出外周血樣品，4000 r/min離心8 min，分離出上層血漿成分，向試管中加入等體積的PBS 稀釋試管中成分， 再加入淋巴細胞分離液，繼續梯度離心，獲取外周血單個核細胞。加入藻紅蛋白 （PE） 標記的CD34 單抗20 μL 和PreCP 標記的CD45 單抗10 μL，4℃避光孵育30 min，加入450 μL 溶血素，室溫靜置30 min，混勻，采用流式細胞儀ProCOUNT 軟件檢測，獲得CD34+細胞百分比，參考范圍為0.5%~3.5 %。

1.4 隨訪 所有SAA 患者均接受隨訪，本次隨訪截止日期2020 年6 月。 通過打電話或復診的方式對所有患者均進行2 年隨訪。 根據隨訪情況將SAA患者分為預后良好組50 例和預后不良組10 例。

1.5 統計學分析 采用軟件SPSS 25.0 對數據進行分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。本研究數據符合正態分布， 計量資料以平均值±標準差（±s）表示，兩組間行獨立樣本t 檢驗。 采用COX法分析影響SAA 患者不良預后的因素。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較 與對照組相比，SAA 組患者IL-2 和IL-18 水 平 較 高，CD34+比 例 較 低 （P＜0.05），見表1。

表1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較（±s）

表1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較（±s）

組別 n對照組SAA 組t 值P 值60 60 IL-2(pg/mL) IL-18(ng/L)12.49±2.88 181.26±22.24 58.294 0.000 156.46±26.57 386.28±101.62 16.948 0.000 CD34+（%）1.08±0.42 0.22±0.08 15.581 0.000

2.2 預后不良與預后良好SAA 患者一般資料比較SAA 患者預后不良與預后良好組間性別、年齡、體重、病程、中性粒細胞、血小板數、網織紅細胞數、骨髓淋巴細胞數比較， 差異無統計學意義 （P＞0.05），見表2。

表2 預后不良與預后良好SAA 患者一般資料比較

2.3 預后不良與預后良好SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較 與預后良好組相比，預后不良組患者SAA 患者IL-2 和IL-18 水平較高，CD34+比例較低（P＜0.05），見表3。

表3 預后不良與預后良好SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較（±s）

表3 預后不良與預后良好SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較（±s）

組別 n預后良好組預后不良組t 值P 值50 10 IL-2(pg/mL) IL-18(ng/mL)156.34±17.64 296.38±35.12 18.967 0.000 174.29±25.94 431.67±96.83 16.518 0.000 CD34+（%）0.25±0.09 0.07±0.03 6.218 0.000

2.4 影響SAA 患者患者不良預后的COX 分析 單因素COX 分析顯示，IL-2、IL-18、CD34+均是影響SAA 患者預后的危險因素； 多因素COX 分析顯示，高水平IL-2、高水平IL-18 及低表達CD34+細胞是影響SAA 患者不良預后的危險因素 （HR=2.142，HR=2.086，HR=2.286，P＜0.05）。 見表4。

表4 影響SAA 患者不良預后的COX 分析

3 討論

據流行病學報道，AA 在中國每年的發病率是7.4/10 萬，男女發病率幾乎相等[10]。 SAA 是難治型血液疾病，可危及患者生命，我國為SAA 高發區[11]。目前SAA 在臨床上主要以免疫抑制法治療為主，雖然治療效果明顯， 但是仍然有大約30%的患者治療無效或出現疾病復發現象， 而長期給患者使用免疫抑制劑會容易使患者向腫瘤類疾病轉化[12]。因此在臨床上需要及早預測SAA 患者預后情況，調整治療方案。

在人體細胞免疫系統中，T 淋巴細胞是主要的效應細胞；在AA 疾病發生、發展過程中，T 淋巴細胞扮演著重要角色[13-14]。 Th1 細胞與Th2 細胞之間表達平衡是機體免疫內環境穩定的重要因素。 盧遠強等[15]研究認為骨髓造血功能被抑制主要與Th1 細胞與Th2 細胞之間平衡被打破有關， 隨著Th1 細胞過度表達，Th1 細胞分泌的細胞因子 （如IL-2、IFN-γ 等）含量升高，造血功能被抑制。 IL-2細胞抗原活化后產生的一種多效性細胞因子，主要由CD4+和CD8+T 細胞產生，以自分泌或旁分泌的方式參與免疫應答[16]。 有研究發現IL-2 水平異常升高與免疫紊亂相關[17]。 IL-18 主要由巨噬細胞和Kupffer 細胞產生， 是一種多效性細胞因子，可參與調節先天性和獲得性免疫反應。 以往研究顯示IL-18 具有抗腫瘤作用，其作用機制是通過抑制腫瘤血管生成、 增加腫瘤細胞毒性進而抑制腫瘤細胞生長[18]。 近年來發現IL-18 能作用于Th1 細胞， 已有研究認定在T 細胞和自然殺傷細胞中，IL-18 是IFN-γ 的誘導因子，可誘導IFN-γ 產生，并促進Th1 細胞極化[19]。 IL-18 可通過調節CD8+細胞毒性，導致骨髓造血細胞凋亡[20-21]。 本研究發現SAA 患者血清中IL-2、IL-18 水平顯著高于健康體檢者，且預后不良組顯著高于預后良好組，與Dutta A[22]、夏正萍等[17]研究顯示外周血IL-2 在獲得性AA 較正常對照者顯著升高相一致，提示IL-2、IL-18 可能與SAA 患者發生有關，對SAA 患者預后不良可能也具有一定的影響， 但對于具體作用機制仍需深入研究。

SAA 患者骨髓造血干細胞是T 細胞和Th1 型淋巴因子的靶細胞，骨髓CD34+細胞數減少與骨髓造血細胞數減少有關， 骨髓抑制性細胞因子 （如IFN-γ、TNF-α 等）通過TRAIL 等途徑在體外誘導CD34+細胞凋亡[23]。 CD34+抗原是造血干細胞表面的一種糖蛋白，其在造血干細胞中呈特異性表達[24]。國外學者Choudhury 等[25]研究顯示，CD34+在多數AA 患者中水平較低。 本研究發現，SAA 患者外周血中CD34+表達水平較健康體檢者低，且預后不良組患者低于預后良好組，提示外周血CD34+細胞表達水平與SAA 發生、發展有關，對SAA 預后不良可能具有評估作用。 研究進一步采用COX 分析顯示，高水平IL-2、高水平IL-18 及低表達CD34+是影響SAA 患者不良預后的危險因素， 提示監測外周血IL-2、IL-18、CD34+細胞水平對預估SAA 患者預后情況可能具有作用。

綜上所述，SAA 患者血清IL-2、IL-18 水平明顯升高，CD34+水平降低，高水平IL-2 及IL-18、低CD34+是SAA 不良預后的危險因素。但本研究僅納入60 例SAA 患者檢測分析，可能影響結果的準確性， 因此后期可在大樣本量基礎， 并延長隨訪時間， 對IL-2、IL-18、CD34+細胞在疾病中作用機制進行深入分析。