八種藏藥材體外抗菌活性評價*

王朔 趙宏濟 嚴達世 王鴻偉 趙思遠 杜寶中

（西藏大學醫學院，西藏 拉薩 850000）

抗生素自從問世以來就成為了人類對抗疾病的有力武器，近百年來更是成為了現代醫學的基石之一，除了被用于治療一系列感染性疾病外，也經常被當做預防和支持用藥，用于器官移植和化療等現代醫療程序。21世紀，平均預期年齡大幅度的上升與抗生素的發現密切相關，它經常被看做是一種萬能藥［1］。但隨著抗生素越來越廣泛的使用，抗生素耐藥性的問題也變得日益嚴重，現在已經成為全世界公共衛生的關注焦點［2］，抗生素的耐藥性會帶來諸多危害，如醫療成本的增加、住院時間延長，不僅可能導致患者的臨床轉歸變差甚至是死亡風險的增加。據統計，目前全年世界每年至少有70萬的患者因為耐藥菌的感染而死亡，在2050年前抗生素耐藥問題如果得不到有效的改善，因耐藥菌感染的死亡人數有可能增加至1000 萬［3］。新的耐藥菌不斷出現使尋找解決細菌耐藥性有效方法成為當前臨床亟待解決的問題。近年來，相關研究人員陸續開發了一些全新結構和作用機制的抗菌藥物用于臨床，如新型β-內酰胺酶抑制劑、頭孢地爾、吉布達星等，當前看來這些藥具有一定的臨床應用前景［4］，但是新型抗生素的臨床運用會使病原菌出現新的耐藥機制，耐藥菌也會越來越廣泛［5］。2019 年，Ursula Theuretzbacher等對正在進行臨床試驗以及獲批的50 余種（截至2018 年7 月1 日）新開發的抗菌藥物進行相關分析后發現［6］，抗菌藥物耐藥趨勢是現有研發抗菌藥物難以應對的，故需要尋找其他的有效途徑以解決臨床耐藥菌治療問題。目前許多學者開始將目光投向具有較小毒副作用、安全性高、來源廣泛、價格低廉等優點的傳統醫藥，如中草藥、藏藥等。經過長期臨床實踐，許多傳統醫藥常用藥材具有良好的抗菌作用，且相對毒副作用較小，作用靶點多，細菌不易對其形成耐藥，因此從傳統醫藥常用藥材中尋找開發新型抗菌藥物解決細菌耐藥性問題有著廣闊的前景［7］。藏醫藥是中國民族醫藥的重要組成部分，位列四大民族醫藥榜首。西藏地區藏醫藥材資源豐富、來源廣泛，藏醫理論體系完善、治療方式獨特，深受人們的肯定與信賴。

本研究評價了8 種藏藥材乙醇超聲提取物對6 種臨床常見病原菌的體外抗菌活性，希望為新型抗菌藥物的開發提供一定的實驗數據，為細菌感染性疾病的臨床治療提供一定的參考。

1 材料

1.1 實驗藥材

8 種試驗藏藥材均為自采于西藏本地，陰干后備用。試驗藏藥材名稱、用藥部位及自采地見表1，自采試驗藥材均由西藏大學醫學院藥學系“藥用植物學”副教授卓瑪東智確認。所用藥材部分留樣保存于西藏大學醫學院病原生物學實驗室，以備查驗。

表1 8種試驗藏藥材名稱、用藥部位及產地

1.2 實驗菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、糞腸球菌（ATCC 29212）、枯草芽胞桿菌（ATCC6633）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯桿菌（ATCC700603）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）均由西藏大學醫學院病原生物學實驗室保存。

1.3 培養基與試劑

MH 肉湯培養基購自英國OXOID 公司；營養瓊脂培養基購自北京天壇生物公司；按照說明書配制，置于4 ℃冰箱一周內使用。

75%、95%及無水乙醇購自成都化學試劑廠，65%乙醇由無水乙醇自行配制；DMSO 購自天津科密歐試劑有限公司。

1.4 實驗器材

電子稱（瑞士梅特勒—托利多公司）、B2 生物安全柜（美國Thermo 公司）、Buchi R 300 旋轉蒸發儀（瑞士布琦有限公司）、G154DW 高壓蒸汽滅菌器（廈門致微公司）、Branson 5800 超聲提取儀（美國必能信公司）、HH.B11.420恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）、麥氏濁度儀（法國梅里埃公司）、微量移液器（德國艾本德公司）、96孔平底細胞培養板（美國康寧公司）等。

2 實驗方法

2.1 試驗藥材乙醇提取物制備

將8 種試驗藥材粉碎，各取50g，分別以500mL 75%、95%、65%乙醇浸泡24h，超聲提取30min，四層無菌紗布過濾，合并濾液，旋轉蒸發儀40℃減壓濃縮至一定體積，將濃縮液轉移至無菌平皿中真空冷凍干燥備用。

2.2 試驗藥物原液制備

電子稱稱取各提取物0.4g～0.6g，以DMSO 溶解定溶至50mg·mL-1藥物原液備用。

2.3 試驗菌液的制備

將保存的試驗菌株劃線接種于營養瓊脂培養基平板，37℃過夜培養，再次營養瓊脂培養基平板接種復壯，挑取單菌落以無菌生理鹽水為稀釋液比濁儀比濁制備0.5 麥氏單位菌液，菌液以MH 肉湯培養基1:100稀釋，即為試驗菌液，15 min內接種使用。

2.4 試驗藥材乙醇提取物體外抗菌活性測定

本實驗采用微量稀釋法。操作簡述如下：取無菌96 孔平底細胞培養板，分別于每行的1 至11 孔加入MH培養基100μL，然后于每四行的第1孔中加入受試藥物100μL，混勻后吸取100μL 轉移至第2 孔中，并以此類推進行二倍稀釋至第11 孔，混勻后棄掉100μL；每四行的1 至3 行前11 孔加入100μL 試驗菌液，第4行1 至11 孔加入100μL MH 培養基作為“無菌生長孔”（陽性對照）。每試驗藥液的最終濃度為50mg·mL-1、25mg·mL-1、12.5mg·mL-1、6.25mg·mL-1、3.125mg·mL-1、1.563mg·mL-1、0.781mg·mL-1、0.391mg·mL-1、0.195mg·mL-1、0.098mg·mL-1以 及0.049mg·mL-1。A12～D12 加入200μLMH 培養基作為“培養基對照”，E12～H12 分別加入100μLMHB 培養基和試驗菌液作為“菌液對照”（陰性對照）。96 孔平底細胞培養板置于滅菌濕盒中，37℃恒溫箱培養24h后觀察結果。

2.5 結果評定

光線充足條件下與對照孔（陽性對照、陰性對照）比較，檢視各實驗孔菌株生長情況。96孔平底細胞培養板內MH培養基呈混濁狀或有菌膜生長等則判定為有菌生長，反之則判定為無菌生長。其中，無菌生長孔所含最低藥物濃度即為試驗藥物的MIC（最小抑菌濃度）值。

3 結果

8 種藏藥材乙醇提取物對3 種革蘭氏陰性試驗菌株MIC 見表2。8 種藏藥材乙醇提取物中川西錦雞兒對銅綠假單胞菌的MIC 值為6.25 mg·mL-1、昆侖蒿對大腸埃希菌MIC 值為3.125 mg·mL-1，這兩個藏藥的提取物能體現出對革蘭氏陰性試驗菌株有一定的抑制活性，其余提取物對三種革蘭氏陰性菌抑菌活性不甚理想（MIC≥12.5mg·mL-1）。

表2 8種藏藥材乙醇提取物對3種革蘭氏陰性菌株的MIC值（mg·mL -1）

8 種藏藥材乙醇提取物對3 種革蘭氏陽性試驗菌株抑菌活性優于三種革蘭氏陰性菌株，其中藏沙蒿對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC 值達0.781mg·mL-1、齒苞黃堇對金黃色葡萄球菌的MIC 值達0.781mg·mL-1、昆侖蒿對糞腸球菌的MIC值達0.391mg·mL-1、川西錦雞兒對金黃色葡萄球菌的MIC 值達0.781mg·mL-1、藏麻黃提取物對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC 值分別達0.195mg·mL-1和0.391mg·mL-1，對枯草芽胞桿菌的MIC為3.125 mg·mL-1。8種藏藥材乙醇提取物對枯草芽胞桿菌的體外抗菌活性最好的為吉隆風毛菊，MIC值達0.195 mg·mL-1。各提取物對3種所試革蘭氏陽性菌的具體MIC見表3。

表3 8種藏藥材乙醇提取物對3種革蘭氏陽性菌株的MIC值（mg·mL -1）

4 討論

本研究所試八種藏藥材乙醇提取物對六種所試菌株均有不同程度的體外抗菌活性。其中對三種革蘭氏陽性試驗菌株的體外抗菌活性均優于三種所試革蘭氏陰性菌株，此可能與兩類試驗菌株的結構差異有關。革蘭氏陰性菌細胞含有較厚的脂質外膜、細胞膜以及周漿間隙，各種殺菌物質相較于革蘭氏陽性菌而言不易進入細胞內發揮作用，故而在多數藥用植物抗菌活性研究中對革蘭氏陰性菌抗菌活性不如革蘭氏陽性菌，本研究結果亦是如此。

三種蒿屬植物對三種革蘭氏陽性菌具有較強的抑制作用（除了臭蒿對糞腸球菌的抑制作用不甚理想）。蒿屬植物多具有清熱解毒、祛風除濕、抗菌消炎等功效，蒿屬植物富含黃酮、揮發油等化合物，其抗菌作用多與這些成分有關［8］；齒苞黃堇為紫堇屬植物，有研究表明該屬植物的抗菌作用主要與其所富含的異喹啉生物堿和多酚化合物有關［9］。錦雞兒屬藏藥化學成分主要包括黃酮類、二苯乙烯低聚體類、苯丙素、香豆素、萜類和甾體等類型化合物，所以川西錦雞兒的抗菌作用可能與這些成分有關［10］；吉隆風毛菊對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性比較強，可能和其所含的小極性的揮發油或萜類成分有關［11-12］；二萜類化合物是翠雀屬植物的特征性化合物，被公認是有效成分和毒性成分，藍翠雀花的抑菌作用可能與此類化合物相關［13］；藏麻黃為麻黃科麻黃屬藏醫常用藥材，具有止血、清脾熱的功效［14］，其抗菌作用研究尚未見報道。研究顯示麻黃主要化學成分包括生物堿類、黃酮類以及揮發油類等［15］，藏麻黃抗菌活性可能與其所含這些成分的作用有關。。

現代藥理學研究發現，傳統醫藥所用藥材成分復雜，常經多成分作用于多靶點，通過多種代謝途徑發揮治療作用［16］。抗菌活性初步篩選常常是基于藥材的體外抑菌試驗來進行的，然而，研究顯示，許多傳統醫藥藥材不僅對病原菌具有直接抗菌活性，也可通過增強機體免疫力、降低病原菌的毒力等發揮體內抗菌活性，比如，淫羊藿多糖對T 細胞的增殖和分化有直接強化作用［17-18］；豬岑、黨參和黃芪可以提高外周血淋巴細胞的轉化率和雞淋巴細胞花環（ERFC）的形成率［19］。本研究結果顯示，藏麻黃提取物對糞腸球菌以及吉隆風毛菊對枯草芽胞桿菌具有較強的體外的抗菌效果（兩者MIC=0.195mg·mL-1），具有進一步深入研究其具體抗菌活性成分、作用機制以及評價其體內抗菌活性的潛力。