生脈散對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用機制的研究

陳 稚，劉 昆，劉 薇，袁康瑞，葉曉梅，吳都督，盧洪梅，2*（.廣東醫科大學，廣東東莞 523808；2.廣東醫科大學附屬東莞第一醫院，廣東東莞 523000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是由糖尿病引起的慢性腎臟疾病，臨床上主要以腎小管間質纖維化為病理特征。目前臨床上常用的治療方式有飲食替代療法、血糖血壓控制療法以及藥物療法等。近年來，中藥復方因具有多成分、多靶點、多功效、整體調節糖代謝、改善腎功能的作用成為研究的熱點。生脈散最早起源于金朝的《醫學啟源》，配方組成為人參、麥門冬、五味子三味中藥，具有益氣生津，斂陰止汗的功效，臨床上主要用于治療冠心病、呼吸系統疾病、慢性心力衰竭、缺血性中風等疾病，有研究發現它還可用于氣陰兩虛型糖尿病及其并發癥的治療，并對腎臟有較好的保護功效[1]，但目前關于生脈散治療糖尿病腎病的作用機制并未明了。因此，本研究將通過經腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構建胰島素腎病的大鼠動物模型，觀察不同劑量的生脈散治療模型動物后腎組織的病理變化，并分析其對模型動物糖脂代謝、24 h 尿蛋白、腎功能以及蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白的影響，以探討生脈散改善糖尿病腎病的影響以及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 7600 型全自動生化分析儀（Beckman 公司，美國），BX60 型光學顯微鏡（日本 OLYMP US 公司），AUW120D 電子分析天平（Shimadzu 公司，日本），DYCP-24DN 電泳儀（北京六一儀器廠，中國），WB 紅外顯影儀（Gene Company Linited 公司，美國），ABI 9700 逆轉錄PCR 儀（ABI 公司，美國），PikoReal熒光定量PCR 儀（Thermo Scientific 公司，美國），便攜式血糖儀（江西奧斐特商貿有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 受試藥物如《方劑學》第七版所載：人參、麥冬、五味子，按3∶3∶2 比例組成，即人參9.0 g、麥門冬9.0 g、五味子6.0 g，麥冬和五味子用10倍量水煎煮1.5 h 后，人參用10 倍水另煎1.5 h，三者相互混合，濾出藥液，濃縮至0.5 g/mL。生脈散用藥劑量依據2015 年版《中華人民共和國藥典》，參考《藥理試驗方法學》中人和動物體表面積比值計量表折算的等效劑量，得出用藥總量為200.00 mg/kg，將該劑量設為中劑量；將400.00、50.00 mg/kg 分別設為高劑量和低劑量。氯沙坦鉀（北京百靈威科技有限公司，國藥準字：H20200780），尿蛋白含量檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：P0506），STZ（上海金穗生物科技有限公司，批號：40584628），TRIzol 試劑（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：22006-1-AP），實時定量PCR 試劑盒（北京生物有限公司，批號：654744），GSK-3β、AKT 蛋白（北京冬歌博業生物科技有限公司，批號：405267 及364142）。

1.1.3 實驗動物和分組 SD 大鼠60 只，雄性，SPF級，身體質量（100±10）克，由廣東醫科大學動物實驗中心提供，許可證號碼SCXK（粵）2021-0008。大鼠飼養于廣東醫科大學動物實驗中心動物房，飼養環境室內溫度（25±2）℃，濕度50%～70%，12 h 晝夜間斷照明，動物自由飲水進食，期間定時定量添加飼料及更換墊料。進行適應性喂養1 周后，大鼠隨機被分為對照組（10 只）和造模組（50 只），造模組用高糖高脂飼料持續喂養8 周并結合腹腔注射30 mg/kg STZ 誘導大鼠建立糖尿病腎病模型[17]；對照組大鼠喂養普通飼料。

1.2 方法

造模成功的糖尿病大鼠隨機被分為模型組、氯沙坦鉀組（16.00 mg/kg）、生脈散低劑量組（50.00 mg/kg）、生脈散中劑量組（200.00 mg/kg）和生脈散高劑量組（400.00 mg/kg），每組10 只。生脈散低、中、高劑量組每日定時以相應劑量生脈散藥液灌胃，模型組和對照組給予等量0.9% NaCl 溶液灌胃，連續6 周，期間配合普通飼料喂養。

1.3 檢測指標

1.3.1 大鼠糖脂代謝的測定 所有動物在取標本前均禁食并自由飲水，禁食12 h 后，采用剪尾法從尾靜脈末梢取血0.2 mL 收集于干燥試管中，3 000 r/min 離心15 min 后，取血清用于檢測。采用血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖濃度，用全自動生化分析儀檢測甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白濃度。

1.3.2 24 h 尿蛋白、腎功能相關指標的測定 所有動物在取標本前均禁食并自由飲水，禁24 h 后，收集24 h尿液，采用放射免疫法測定24 h 尿微量蛋白含量，操作嚴格按照說明書進行。取各組大鼠血清，全自動生化分析儀檢測腎功能相關指標血肌酐和尿素氮的含量。

1.3.3 HE 染色觀察腎臟組織病理變化 處死大鼠后取出大鼠腎臟組織，經生理鹽水漂洗后用福爾馬林溶液固定，切片，進行HE 染色，顯微光鏡下觀察大鼠腎臟結構變化

1.3.4 Western Blot 法測定腎組織Akt、GSK-3β 蛋白的表達 取各組大鼠腎臟組織約50 mg 勻漿，加入細胞裂解液RIPA 提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白水平。將提取的蛋白樣品經過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉移至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，然后分別加入GSK-3β抗體稀釋液（1∶1 000）和β-actin 抗體稀釋液（1∶300），4 ℃下孵育過夜。最后加入二抗，室溫孵育2 h，電化學發光顯影檢測。采用Image J 軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統計學處理。計量資料以表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生脈散對大鼠糖脂代謝的影響

與對照組比較，模型組大鼠的空腹血糖升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；甘油三酯（膽固醇或低密度脂蛋白）水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，氯沙坦鉀組和生脈散低、中、高劑量組大鼠的空腹血糖水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；甘油三酯（膽固醇或低密度脂蛋白）水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 生脈散對大鼠糖脂代謝的影響 （，n=10，mmol·L-1）

表1 生脈散對大鼠糖脂代謝的影響 （，n=10，mmol·L-1）

與對照組比較：aP＜0.05；與模型組比較：bP＜0.05

2.2 生脈散對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白及腎功能的影響

與對照組比較，模型組大鼠的24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，氯沙坦鉀組和生脈散中、高劑量組大鼠的24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，生脈散低劑量組24 h 尿微量白蛋白、尿素氮水平均降低（P＜0.05），肌酐水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 生脈散對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白及腎功能的影響 （，n=10）

表2 生脈散對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白及腎功能的影響 （，n=10）

與對照組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01，cP＜0.05

2.3 生脈散對大鼠腎組織病理變化的影響

對照組大鼠腎組織細胞形態結構完整清晰，未發生明顯病理變化。模型組大鼠腎小球基底膜增厚，體積變大，腎小管基膜增厚或分裂，結節性腎小球硬化。生脈散高劑量組大鼠腎臟組織壞死細胞較對照組明顯減少，腎小管結構基本完整。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理變化

2.4 生脈散對糖尿病腎病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠Akt 蛋白表達水平降低，GSK-3β 蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，生脈散低、高劑量組大鼠Akt 蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01），生脈散低劑量組GSK-3β 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），生脈散高劑量組GSK-3β 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。見圖2、表3。

表3 生脈散對糖尿病腎病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表達的影響（，n=10）

表3 生脈散對糖尿病腎病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表達的影響（，n=10）

與正常組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01

圖2 生脈散對對糖尿病腎病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白的表達

3 討論

糖尿病腎病屬于糖尿病引發的嚴重并發癥之一，一旦形成便難以治愈，是一種危害極大的慢性疾病，也是導致終末期腎臟病的重要原因[2]。有文獻報道生脈散對糖尿病及其并發癥具有較好的治療效果，其中麥冬多糖能顯著降低糖尿病腎病大鼠腎臟指數和BUN水平，降低腎臟p47phox、NF-κB 的表達[3]；人參皂苷通過調節血清氧化應激指標，下調炎性因子和以及腎組織相關蛋白的表達來改善DN 大鼠腎功能[4]；五味子提取物可提高糖尿病大鼠的腎臟MMP-2 活性、抑制TIMP-2 的表達來改善腎小球細胞外基質降解[5]。

本研究通過采用腹腔注射STZ（40 mg/kg）的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，并觀察生脈散對大鼠糖脂代謝、24 h 尿蛋白、腎功能、腎組織病理變化的影響。實驗結果發現，生脈散干預后，不同劑量組糖尿病腎病大鼠的血糖、24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平均低于模型組（P＜0.01 或0.05），且生脈散高劑量組大鼠腎臟組織病變減輕，壞死細胞較模型組更少且腎小管腎小球結構基本完整，說明生脈散可顯著改善糖尿病腎病大鼠的腎組織，減少糖尿病對腎組織損傷，對DN 大鼠的腎功能起到保護作用。

Akt/GSK-3β 信號通路具有調節血糖的作用，與大鼠腎功能密切相關，是重要的胰島素信號通路。Akt蛋白能調控細胞的增殖與凋亡，共有Akt1、Akt2 和Akt3 三種有著相同結構的蛋白異形體。有研究表明Akt1 和Akt2 在TGF-β1 介導的大鼠腎小管上皮細胞轉分化過程中過度表達，從而促進糖尿病并發癥的發生[6]。并且Ying 等[7]發現，通過激活Akt 信號通路抑制氧化應激，可以改善膜細胞凋亡，減緩糖尿病造成的腎損傷。此外，陶海英等[8]發現，隨著大鼠腎臟組織Akt 蛋白水平的升高，大鼠24 h 蛋白尿和腎臟指數均顯著降低，肌酐清除率顯著升高，其機制可能是通過調節Akt 蛋白表達，從而減緩糖尿病腎病模型大鼠的腎損傷。

抑制GSK-3β 活性，可降低DN 大鼠蛋白尿水平，改善腎臟凝血纖溶狀態，對腎臟起到保護作用。王雪梅等[9-10]發現GSK-3β 可通過磷酸化多種內源性底物，包括參與代謝的多種蛋白和轉錄因子等，在血糖穩態調控、細胞生長、發育等過程中發揮重要作用。由此可見，探索Akt/GSK-3β 信號通路是研究生脈散對DN 大鼠的保護作用的重要途徑。

本研究western blot 的結果表明，生脈散可抑制糖尿病大鼠GSK-3β 蛋白的表達，上調Akt 蛋白的表達，與模型組比較，生脈散各劑量組大鼠腎臟GSK-3β 蛋白表達顯著降低，Akt 蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01），且生脈散高劑量組較低劑量組對Akt、GSK-3β 蛋白的表達影響更明顯，這提示Akt/GSK-3β信號通路對DN 大鼠的腎功能起著至關重要的作用。生脈散減緩糖尿病致腎損傷的機制可能是通過調控Akt、GSK-3β 蛋白表達，從而減緩氧化應激造成的大鼠腎損傷，達到治療大鼠糖尿病腎病的目的。