基于網絡藥理學探討桃仁-紅花藥對治療膝骨性關節炎的作用機制

賴財榮 雷 升 竇志芳* 任錫祿

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis, KOA）是一種退行性疾病，主要表現為多種致病因素作用下軟骨細胞及細胞基質合成與分解的動態平衡被打破，從而導致膝關節軟骨的破壞增生，繼而導致關節間隙變窄，臨床主要表現為關節疼痛、關節腔積液，甚至活動障礙；在最新的風濕協會關節炎管理指南中提到，KOA的治療以緩解癥狀、減輕病情為主要手段，主要采用非甾體抗炎藥及解熱鎮痛藥等緩解患者的癥狀、透明質酸及氨基葡萄糖等藥物來減緩病情的發展[1]；在疾病的后期甚至通過手術治療KOA；長期服用西藥不僅引起一系列身體損傷，而且價格昂貴；中醫藥治療KOA有獨特的優勢，不僅廉價、不良反應少，療效也可以保證[2-4]。

桃仁-紅花藥對出自《醫宗金鑒》桃紅四物湯。桃仁苦以泄滯血，紅花辛散溫通，活血通經，散瘀止痛，兩藥相須為用，一升一降，一散一收，活血祛瘀之力倍增，且有活血生新，消腫止痛之功。KOA屬于中醫“痹癥”“痹病”的范疇。桃仁、紅花藥對已廣泛應用于KOA治療中，身痛逐瘀湯等治療KOA的經典方劑中就包含桃仁、紅花這一藥對；但對這一藥對治療KOA的作用機制尚無系統闡述。網絡藥理學作為一個新興學科，基于分子層面，通過數據的可視化分析，構建藥物-有效成分-疾病-靶點網絡來預測藥物治療疾病的作用機制。本研究基于網絡藥理學探討桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制，為中醫藥治療KOA提供理論依據。

1 方法

1.1 篩選“桃仁-紅花”有效成分和靶點

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP, http://tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“桃仁、紅花”為藥物名稱，分別檢索出相應藥物的有效成分，并根據口服生物利用度（oral bioavailability, OB）以及類藥性（drug likeindex, DL）對其進行篩選，OB是指藥物被吸收進入人體循環的速度與程度；DL指的是化合物與已知藥物的相似性。相關研究表明，OB＞30%具有較好的口服生物利用度，DL＞0.18具有較好的類藥性[5]。本研究通過上述兩個指標對藥物有效成分進行篩選，得到符合標準的有效成分，并通過TCMSP數據庫預測篩選后成分的作用靶點，再把預測的靶點基因導入到Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）進行基因標準化。

1.2 篩選KOA相關靶點基因

在藥物作用靶點數據庫（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http://www.omim.org/）和人類基因數據庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）網站輸入“Knee osteo arthritis”為關鍵詞進行檢索，并下載相關的靶點信息，為了篩選出與疾病相關性高的靶點信息，故將GeneCards數據庫檢索的疾病靶點按Relevance score＞10進行整理，再將3個數據庫得到的靶點基因合并。再導入Uniprot 數據庫（http://www.uniprot.org/）進行基因標準化命名并刪除重復值。

1.3 藥物、疾病共同靶點的篩選及韋恩圖的構建

將藥物相關靶點基因和疾病靶點基因導入到微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖工具構建韋恩圖，并得到藥物與疾病的共同靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將藥物與疾病的共同靶點基因數據導入String數據庫（https://string-db.org/），物種設置成“Homo sapiens”（人類），選擇高置信值0.700，刪除游離蛋白，下載TSV數據文件，再將其導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具計算出Degree值，根據Degree值篩選出核心基因。

1.5 藥物-有效成分-疾病-靶點網絡的構建

將藥物有效成分、及藥物相關靶點基因、藥物與疾病交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物-有效成分-疾病-靶點網絡，并通過NeteworkAnalyzer工具進行分析，得到各個節點的Degree值，并根據Degree得出核心的藥物成分。

1.6 生物學功能與通路分析

將疾病與藥物的交集靶點基因導入Metascape數據庫（http://metascape.org），物種選擇人類，進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，設定標準為P值小于0.01、最小計數為3和富集因子大于1.5。運用微生信（http: //www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖工具將P-value最小的前20條結果制作成氣泡圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 桃仁-紅花藥對化學成分生物口服利用度和類藥性

共獲得桃仁、紅花有效成分45個，其中桃仁有效成分23個，紅花有效成分22個。桃仁及紅花有效成分生物口服利用度和類藥性見表1。

表1 桃仁、紅花有效成分生物口服利用度和類藥性

2.2 桃仁-紅花藥對主要成分的預測靶點結果

得到桃仁相關的靶點基因252個，紅花相關靶點基因436個，其中MOL001339、MOL001343、MOL001348、MOL001350、MOL001371、MOL002680、MOL002698、MOL002706、MOL002707、MOL002719未找到相應的靶點基因。最終得到桃仁-紅花藥對成分相關靶點基因為656個。

2.3 桃仁-紅花藥對與KOA交集靶點韋恩圖

桃仁-紅花藥對的靶點基因共得到129個，KOA的靶點基因有518個，兩者的交集靶點為43個。見圖1。

圖1 桃仁-紅花藥對與KOA交集靶點韋恩圖

2.4 藥物-疾病交集靶點PPI網絡

藥物-疾病交集靶點PPI網絡中有節點39個，168條邊。見圖2。前10位核心基因分別為IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2。

圖2 桃仁-紅花藥對-KOA交集靶點PPI網絡

2.5 藥物-有效成分-疾病-靶點網絡的構建

藥物-有效成分-疾病-靶點網絡340條邊，80個節點，包括疾病節點1個，藥物節點2個，基因節 點43個，桃仁成分節點18個，紅花成分節點17個。得到Degree值排前5的有效成分分別為quercetin（槲皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、baicalein（黃芩素），其Degree值分別為41、30、21、20、13。見圖3。

圖3 藥物-有效成分-疾病-靶點網絡

2.6 生物學功能與通路分析結果

結果共獲得598條GO功能條目（P＜0.01），其中包括468條生物過程，87條細胞組分，43條分子功能。生物過程主要富集在炎癥反應（inflammatory response），對傷害的反應（response to wounding），細胞遷移的正調控（positive regulation of cell migration），細胞運動的正調控（positive regulation of cell motility），細胞成分運動的正調控（positive regulation of cellular component movement）等。細胞組分主要富集在轉移酶復合物（transferase complex）、核染色體（nuclear、chromosome）、囊腔（vesicle lumen）、泛素連接酶復合物（ubiquitin ligase complex）、cullin環泛素連接酶復合物（cullin-RING ubiquitin ligase complex）等。分子功能主要富集在絲氨酸型內肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、絲氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、內肽酶活性（endopeptidase activity）、肽酶活性（peptidase activity）等。見圖4～6。

圖4 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的生物過程結果

圖5 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的細胞組分結果

圖6 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的分子功能結果

2.7 KEGG信號通路富集分析結果

共獲得KEGG信號通路121條，刪除“cancer”相關通路，選擇P-value值最小的前20條通路。與KOA相關的通路主要有糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）。見圖7。

圖7 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的KEGG信號通路

3 討論

KOA屬于中醫“痹癥”“痹病”的范疇，早在《黃帝內經》就對痹病有了較為詳細的論述，如《素問·痹論》提出：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹”，指出了痹癥的病因病機為邪氣侵襲，導致經絡閉阻。《類證治裁·痹癥》：“諸痹，風寒濕三氣雜合，而犯其經絡之陰也。風多則引注，寒多則掣痛，濕多則重著，良久營衛先虛，腠理不密，風寒濕乘虛內襲， 正氣為邪氣所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹”；清代王清任的“瘀血致痹”理論中認為瘀血不止是痹癥的產物，同時也是致病因素，主張活血化瘀為治療基本原則。中醫藥治療KOA歷史悠久，具有獨特的優勢以及顯著的療效。孫壯等[6]的研究發現身痛逐瘀湯聯合透化系統可以很好地降低相關炎癥介質水平，抑制炎癥反應，有效改善患者癥狀，相對于單純透化治療效果更明顯。包杭生等[7]研究發現補陽還五湯可有效改善KOA患者的WOMAC評分，調節關節液中炎癥介質，促進骨髓水腫的吸收，延緩軟骨細胞的破壞和退變。補陽還五湯和身痛逐瘀湯都包含桃仁-紅花藥對，在治療KOA方面取得了良好的效果。本研究基于網絡藥理學從成分、靶點、通路等角度揭示桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制，為中醫藥治療該疾病提供理論依據。

本研究篩選出桃仁-紅花藥對治療KOA的主要成分為槲皮素、beta-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、黃芩素等。槲皮素可以通過抑制核因子κB激活，減弱炎癥環境下軟骨細胞內MMP-13產生，降低MMP-13/TIMP-1比例，抑制軟骨細胞外基質的降解和細胞凋亡，起到保護軟骨的作用[8-9]，槲皮素也可以通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎癥介質和金屬蛋白酶（MMP-3和MMP-9）的表達，以此改善KOA患者的癥狀[10]。相關研究發現，山奈酚通過抑制細胞內的MAPK和核因子KB通路活性，從而抑制IL-1β誘導的成纖維細胞（RASF）增殖、環氧化酶-2（COX-2）的表達與前列腺素E2（PGE2）的產生，且還可抑制TNF-α在成骨細胞中誘導信號的傳導，從而減少IL-6和MCP-1的分泌，以此減輕滑膜炎癥，同時還可通過抑制C-FOS的表達，阻斷RANKL誘導破骨細胞的生成[11-12]。木犀草素可降低NLRP3炎性小體活化，減少血漿內IL-1β和IL-18水平，增強骨保護素的表達，減輕膠原激活炎癥所導致的骨破壞[13]。黃芩素可通過抑制因IL-1β刺激而引起的caspase-3活化，提高Bcl-2表達量和抑制PARP裂解，從而對軟骨細胞的凋亡起到保護作用，還可提高SOX-9的表達量，從而促進軟骨細胞分泌細胞外基質（ECM），加強兩者的相互作用，達到治療KOA的目的[14]。

將藥物-疾病交集靶點進行PPI網絡分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具得出來的網絡前10位核心基因，分別為IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2等。推測桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制可能與上述靶點基因密切相關。研究發現IL-1β可誘導產生IL-6，IL-6可以作用于B淋巴細胞，通過分泌形式作用于軟骨細胞，抑制軟骨細胞的分裂和蛋白聚糖的合成[15]，還可以增加滑膜組織中炎癥細胞，使MMPs的表達增多，細胞外基質的合成與降解失衡[16]。劉豐等[17]的研究發現血管內皮生長因子（VEGF）可促進血管生成和增加血管通透性，是KOA發展過程中重要炎癥介質，VEGF還通過影響MMPs與TIMPs，導致軟骨細胞增殖與凋亡之間的平衡破壞，MMPs的增加使降解細胞外膠原和蛋白多糖的速度加快，加速了軟骨細胞的破壞[18]。CCL2屬于趨化性細胞因子，在炎癥介質（IL-8，TNF等）刺激下，由單核細胞和巨噬細胞等產生，在成骨細胞、破骨細胞等表達，參與炎癥反應[19-20]。相關研究發現，關節炎患者血清與滑膜液中的CCL2水平與疼痛水平和殘疾程度正相關，CCL2優先介導單核細胞運輸，促進了KOA的炎癥反應與組織損傷[21]。崔冠軍等[22]的研究發現COX-2能夠誘導PGE2的產生，PGE2能夠激活滑膜細胞中MMPs的產生，從而導致軟骨細胞的降解、基質細胞的合成和軟骨細胞的凋亡。王海英[23]的研究發現EGF對軟骨細胞的凋亡具有保護作用。未發現JUN、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1、MAPK8）與KOA的相關研究，因此可以作為新的研究方向。

通過藥物-疾病交集基因進行富集分析發現，靶點基因主要富集在糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、恰加斯病、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥的途徑、HIF-1信號通路等信號通路。IL-17信號通路中的IL-17A和IL-17R與靶細胞膜特異性受體結合，通過跨膜受體SEFIR內的信號轉導分子ACT1，活化后的ACT1與TRAF6相結合，最終共同激活核因子κB等炎癥通路[24]，進而導致了KOA癥狀的加重。TNF信號通路介導的炎癥反應對KOA病情的發展起著重要作用，可通過促進CCL2、VEGF、IL-1β、TNF-α的表達，加重機體的炎癥反應[25]。相關研究發現，HIF-1在炎癥條件下被激活，具有調控免疫細胞的存活以及促炎癥介質表達功能[26]，尤其是在炎癥介質白細胞介素的合成中發揮重要作用，同時HIF-1還能促進VEGF的生成，進而通過影響MMPs與TIMPs來促進軟骨細胞的凋亡[27]。糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、恰加斯病、癌癥的途徑等通路未發現有與KOA相關研究，但不排除這些通路與KOA的關系，如需進一步了解，可作為新思路進行研究。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方式得出桃仁-紅花藥物有效成分通過多靶點，多通路產生抑制KOA內的炎癥反應、成骨細胞的表達、軟骨細胞凋亡等作用，進而達到治療KOA的目的。雖然本研究通過網絡藥理學驗證了中醫藥治療KOA有效，但因過程中通過不同數據庫，不同數據庫的相關算法不相同，對該結果還需要后期試驗的驗證。