不同沖泡溫度下滁菊茶湯HPLC指紋圖譜的研究

張俊巍 韓月婷 呂伯龍 王偉 張承 于士軍

摘 要：以滁菊為原料，分別在6種不同溫度下沖泡，建立滁菊茶湯的HPLC指紋圖譜，利用化學計量學方法進行分析。結果表明，滁菊茶湯品質與沖泡溫度有關，18個樣品有6個共有峰。主成分分析提取了兩大主成分，其累積貢獻率達到93.187%。聚類分析可將樣品分為3類，分別為50℃和60℃，70℃、80℃和90℃，100℃。隨著溫度升高，茶湯顏色越濃，活性物質含量越高，茶湯品質也越好。沖泡溫度為100℃時，茶湯品質最佳。為合理沖泡和飲用滁菊茶提供參考和科學依據。

關鍵詞：滁菊;指紋圖譜;沖泡溫度;茶湯品質

中圖分類號 TS275 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0125-05

Study on the HPLC Fingerprint of Chrysanthemum morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju Tea Soup Brewed at Different Temperatures

ZHANG Junwei1? ?HAN Yueting2? ?LV Bolong3? ?WANG Wei1? ?ZHANG Cheng1? ?YU Shijun2

（1Agricultural Products Quality and Safety Center，Xuancheng City，Xuancheng 24200， China 2Chuzhou Academy，Chuzhou City， Chuzhou 239500， China; 3Anhui Tuowei Testing Services Co.， Ltd.，Xuancheng City，Xuancheng 24200，China）

Abstract： The HPLC fingerprints and antioxidant activities of C. morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju tea soup were studied by brewing Chuju tea at 6 different temperatures. The fingerprints were analyzed by chemometrics . The results showed that the quality of Chuju tea soups had a good relationship with the brewing temperature significantly. There are 6 common peaks in the fingerprints of 18 samples .Cluster analysis can divide samples into three categories， namely 50℃ and 60℃， 70℃， 80℃ and 90℃， and 100℃. When the brewing temperature is 100℃， the quality of tea soup is the best. Provide reference and scientific basis for reasonable brewing and drinking of Chuju tea.

Key words： Chuju; Fingerprint; Brewing temperature; The quality of tea soup

菊花是一種常見的藥食兩用的花卉，廣泛應用于中醫臨床和生活食品。滁菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat）Tzvel. cv. Chuju）是多種菊花中效用最為優質的品種。滁菊的生產地區主要在滁州，擁有數百年的栽培歷史[1]。滁菊是當地特色植物資源，也是當地特產，是國家的地理標志性產品。滁菊又可以被叫為“白菊”、“甘菊”，位列中國“四大藥菊”之一[2]。經我國的衛生部批準，滁菊是藥食兼優植物，它有很高的藥用保健價值。滁菊在生活中主要為茶沖泡飲用，也可作為中藥材入藥，同時可以直接食用，是藥、茶、食三用的純天然綠色食品保健品[3]。大量的研究和中藥藥典表明，滁州的滁菊藥用價值很高，含有多酚類、黃酮類和萜類等活性物質，并且含有多糖和微量元素，適量使用后，能夠起到抗氧化、抗腫瘤以及改善缺血心肌的血液供應等作用[4]。

目前，在菊花的品種鑒別、質量檢測控制上已經引入了HPLC指紋圖譜技術。陳曉慶等對滁菊的HPLC特征指紋圖譜進行研究，對10個不同批次的滁菊進行實驗，結果表明，不同批次的菊花之間所含化學成分存在顯著差異，所以可見HPLC指紋圖譜能夠有效區分滁菊與其它菊花，且該方法快捷、準確、重復性好，可為滁菊藥材的鑒別及質量控制提供理論依據[5]。于士軍等對滁菊建立了HPLC指紋圖譜，對其化學計量學進行分析和研究，結果表明，在滁菊的產地選擇和質量評價技術上，可以采用HPLC指紋圖技術[2]。本文主要對滁菊在不同沖泡溫度下滁菊茶湯的浸提液建立滁菊茶湯生物HPLC指紋圖譜，對不同沖泡溫度下的滁菊茶湯浸出物進行主成分、聚類分析，旨在研究不同沖泡溫度下對滁菊茶湯品質和浸出物的的影響，為合理沖泡和飲用滁菊茶提供參考和科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 滁菊、甲醇（色譜純）、磷酸（分析純）、超純水、DPPH、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸溶液，氯化鐵溶液。蘆?。兌?5.5%）購于中國藥品生物制品鑒定所。對照品木犀草苷（批號：MUST-15012204，質量分數>99.77%），綠原酸（批號：MUST-15041814，質量分數>99.39%）;槲皮素（CAS號：117-39-5，質量分數>98.00%）;芹菜素（CAS號：520-36-5，質量分數>98.00%）。

1.1.2 儀器與設備 Agilent1260II高效液相色譜儀、SpectraMaxPlus384全波長酶標儀、BPG-9070A鼓風干燥箱、KQ3200DA數控超聲波清洗器、MINI-10K+微型離心機、HX-01N真空泵、FA2204B分析天平、此外還使用到一次性注射器、0.22μm濾膜、封口膜等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 取4g的滁菊干茶分別放入18個錐形瓶中，依次加入溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，pH為6.0的蒸餾水200mL。搖勻，用保鮮膜對其進行封口，再分別放入相應溫度的水浴槽中保溫，浸提10min。最后用濾網將滁菊過濾，將過濾后的茶湯置于干凈的燒杯中，待用。對滁菊溶出物HPLC指紋圖譜的測定還需取上述各樣液1mL，對樣液離心沉淀雜質，再經0.22μm微孔濾膜過濾，收集濾液于液相樣品瓶中待測。

1.2.2 滁菊溶出物HPLC指紋圖譜的測定 （1）標準品溶液配制。分別稱取干燥至恒重的對照品綠原酸2.4mg、木犀草苷0.8mg、槲皮素0.4mg、蘆丁0.5mg、芹菜素0.5mg，置5mL棕色容量瓶中，加入75%甲醇溶解定容，配制成綠原酸濃度為480μg/mL、木犀草苷160μg/mL、槲皮素80μg/mL、蘆丁100μg/mL、芹菜素100μg/mL的對照品溶液，超聲30min，用0.45μm微孔濾膜將對照品溶液過濾，得待測溶液，備用。

（2）色譜條件。色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：0.4%磷酸水溶液（A）-甲醇（C）;流速：1mL/min;柱溫：30oC;檢測波長：320nm;進樣量：10μL;采用梯度洗脫：0～5min，70%A;11min，62%A;17min，62%A;20min，58%A;22min，50%A;25min，40%A;30min，40%A;35min，70%A;37min，70%A。

2 結果與分析

2.1 HPLC指紋譜圖的建立 采用6種溫度按照“1.2.1”項的方法處理滁菊制備樣品提取液，使用“1.2.2”中的色譜條件，對滁菊茶湯樣品提取液進行測定。將指紋圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）》進行分析，選擇樣品S2的指紋圖譜為參照圖譜，采用多樣本平均數矢量綜合作為共有模式矢量，時間寬度設定為0.50，對色譜峰進行多點校正和全峰匹配，得到指紋圖譜，如圖1。每種沖泡溫度的滁菊茶湯平行實驗3次，一共18個指紋圖譜，共計20個色譜峰，其中有6個色譜峰是18個滁菊茶湯樣品提取液所共有的。計算了各色譜峰相對峰面積，具體實驗結果見表1。

從表1中的數據可以看到，100℃時20個出峰時間均出峰，而50℃時，出峰個數較少，隨著沖泡溫度升高，茶湯出峰的個數也隨之增加。所以不同的沖泡溫度對滁菊活性成分浸出量有影響。將表1中的色譜峰的出峰時間與標準品的色譜峰出峰時間對比之后，確定了樣品中20個色譜峰中的5個色譜峰，其中峰號P4為綠原酸、峰號P10為木犀草甘、峰號P13為蘆丁、峰號P14為芹菜素、峰號P18為槲皮素。

2.2 幾種成分含量測定 由表2可知不同溫度下，滁菊茶湯中的活性物質槲皮素、綠原酸、木犀草甘、蘆丁和芹菜素含量存在顯著性差異（p<0.05）。90℃時槲皮素的含量達到最大值為0.29mg/g，100oC時綠原酸、木犀草甘、蘆丁、芹菜素的含量均達到最大值分別為7.58、1.03、0.55、1.85mg/g。從表2可看出，黃酮類活性物質槲皮素、木犀草甘、蘆丁、芹菜素的含量和多酚類物質綠原酸的含量均隨著溫度的升高而增加，50℃和60℃時，5種活性物質的含量均不存在顯著性差異（p<0.05），隨著溫度的升高，70℃時與50℃和60℃存在顯著性差異（p<0.05），80℃、90℃和100℃時，槲皮素和綠原酸不存在顯著性差異（p<0.05）;木犀草甘、蘆丁和芹菜素在90℃和100℃時不存在顯著性差異，但3種黃酮類物質的含量在沖泡溫度為100℃和80℃時存在顯著性差異。綜上所述，不同的沖泡溫度對滁菊茶湯中的活性物質的溶出量有影響，隨著溫度的升高而增加，槲皮素在90℃時達到最大值，100℃時保持不變，綠原酸、木犀草甘、蘆丁和芹菜素4種活性物質均在100℃達到最大值。

2.3 化學計量學分析

2.3.1主成分分析 將HPLC-DAD指紋圖譜20個峰面積數據導入SPSS 23.0軟件，并對導入的數據進行主成分分析，具體實驗結果見表3。因第三主成分的特征值只有0.584，沒有超過1，所攜帶的信息量不到原來的1個變量，所以本研究提取表3中第一和第二兩個主成分進行分析。

將HPLC-DAD指紋圖譜20個峰面積數據導入SIMCA 14.1統計軟件進行PCA分析，得到PCA主成分載荷圖（a）、（b）2個分圖（圖2），得分圖（a）、（b）2個分圖（圖3）。

圖2的載荷圖能比較明顯的看出區分這些樣品的關鍵變量點，與原點之間的距離越遠，表示其與主成分之間的相關性越高，正方向表示正相關，負方向表示負相關。其中圖（a）表示第一主成分和第二主成分的載荷圖，圖中可以看到色譜峰P1～P20與第一主成分都成正相關，其中與第一主成分相關性較高的有P1、P2、P3、P4、P5、P8、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19。與第二主成分成正相關的有P6、P7、P9、P11、P17、P20，其中相關性較高的有P6、P7、P17。圖（b）表示第一主成分和第三主成分的載荷圖，可以看到，與第三主成分相關性較高的是P11、P20。

根據圖3（a）、（b）的2個主成分得分圖可以看出，6種溫度沖泡滁菊樣品（每種沖泡溫度有3個平行）大致集中在4個區域，每種沖泡溫度均能夠較好的聚在一起。從（a）圖中可以看到沖泡溫度為50℃和60℃的2組非常接近，且2種沖泡溫度幾乎重疊在一起;70℃、80℃和90℃較為接近，這3種沖泡溫度有的重疊在一起;80℃和90℃分布在1個區域，而100℃獨自分布在1個區域。圖（b）中：50℃、60℃和70℃各自能很好的聚為一體，和圖（a）一樣50℃和60℃非常接近幾乎重合;70℃和80℃比較接近;與圖（a）不同的是圖（b）中的90℃獨自在1個得分區域，100℃和80℃在1個區域。綜合分析可以得出，6種不同的沖泡溫度對茶湯中的活性成分浸出量有著不同的影響，低溫的沖泡溫度為50℃、60℃和高溫的沖泡溫度為90℃、100℃有著很明顯的區別，其中50℃、60℃較為接近，70℃和80℃也相對接近。

2.3.2 聚類分析 用SPSS 23.0統計分析軟件對18個樣品的20個峰面積進行標準化處理后，利用NCSS進行聚類分析，采用瓦爾德聚類法，距離的計算方法為歐氏距離，二維聚類分析結果見圖4。

橫向聚類結果為樣品間的聚類分析，據圖可知，在第1次聚類時，18個樣品可聚為6類，即3個重復性試驗可以很好的聚在一起。在距離為0～6.25之間，較低溫度的50℃和60℃聚在一起，偏高溫度的70℃和80℃聚在一起。當距離為6.25時，可以看到18個樣品聚為3類，50℃和60℃聚為一類，70℃、80℃和90℃聚為一類，最高溫度100℃為一類。距離為12.5時，70℃、80℃、90℃和100℃才聚為一類，低溫與高溫沖泡滁菊得到的茶湯差異較大，由圖中可以看到距離達到25時，6種溫度才可聚在一起。說明不同沖泡溫度對滁菊茶湯中的活性成分溶出量有一定的影響，且高溫與低溫對滁菊茶湯的影響很明顯，其中50℃和60℃對茶湯的影響非常接近，70oC和80oC對茶湯的影響較接近，該聚類結果與主成分分析的得分圖結果基本一致。

縱向聚類結果為色譜峰聚類分析，據圖可知，50℃和60℃的色譜峰P1～P20的峰面積都比較小，由圖中的顏色梯度可以看到，相比高溫的顏色，50℃和60℃為負值說明50℃和60℃ 2個溫度的滁菊茶湯中的活性成分的溶出量較少。在70℃時，色譜峰中的P1、P2、P3、P5、P8、P9、P12、P15、P16、P19、綠原酸、槲皮素、芹菜素、木犀草甘、蘆丁的峰面積由顏色梯度可以看到開始變為正值，說明峰面積增大，表示所代表的活性成分在茶湯中含量開始增大。隨著溫度增高，值為負值的峰面積也開始變為正值，其他的峰面積也在增大。當溫度達到100℃時，色譜峰P1～P20的峰面積基本上都是正值并達到最大值，即所代表的活性成分含量最大，這表明溫度越高活性成分的溶出量越大。綜上所述，高溫和低溫沖泡滁菊，其茶湯中活性成分差異較大，說明不同的沖泡溫度對滁菊茶湯中活性成分的溶出量有較大的影響。

3 結論

通過對不同沖泡溫度下滁菊茶湯的HPLC指紋圖譜的化學計量學分析，表明不同沖泡溫度下的滁菊茶湯品質和HPLC指紋圖譜是存在顯著差異的，隨著沖泡溫度的升高，茶湯活性物質含量越高，并在100℃時達到最大值，100℃時茶湯的各項指標基本都顯示最好，所以本研究中100℃為滁菊茶湯的最優沖泡溫度，可以得到較好品質的滁菊茶湯。

參考文獻

[1]張蓓蓓，陳巖，賁培玲.滁菊總黃酮研究進展[J].齊齊哈爾醫學院學報.2016，37（17）：2211-2213.

[2]于士軍，王偉，孫輝，等.滁菊的HPLC指紋圖譜制作及其化學計量學分析[J].生物資源.2017，39（3）：185-191.

[3]吳越.滁菊中有效成分的檢測方法研究概述[J].安徽農學通報.2017，23（19）：16-17.

[4]尹智慧.不同產地藥用菊花有效成分溶出規律研究[D].杭州：浙江中醫藥大學，2015.

[5]陳曉慶，劉家水，張丹雁.滁菊HPLC特征指紋圖譜研究[J].廣東藥科大學學報.2017，33（5）：611-616.

基金項目：安徽省長三角創新聯合公關專項（107085328028）、滁州市科技指導性計劃項目（2021ZD024）。

作者簡介：張俊?。?985—），男，安徽宣城人，農藝師，從事農業產業化、農產品質量安全工作。

通訊作者：于士軍（1983—），男，安徽臨泉人，副教授，主要從事天然產物和食品質量安全方面的研究和教學工作。? 收稿日期：2022-02-28