短鏈脂肪酸對脂多糖誘導的大鼠急性呼吸窘迫綜合征的影響及其作用機制

向小琴，張婷婷，鐘江姍，尹國芳，范賢明*

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應實驗室，四川瀘州 646000

根據(jù)柏林定義，急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一種急性彌漫性肺部炎癥，可導致肺血管通透性及肺重量增加，參與通氣的肺組織減少，其主要臨床特征為急性進行性及頑固性低氧血癥[1]。多種情況可誘發(fā)ARDS，如重癥胰腺炎、外傷、大量輸血、嚴重膿毒癥、肺炎等[2]。ARDS發(fā)病機制復雜，目前主流的觀點認為ARDS的本質(zhì)是炎癥，肺內(nèi)炎性細胞過度活化，釋放過多炎性介質(zhì)，大量炎性因子與炎性細胞相互作用、相互激活，引發(fā)失控的炎癥級聯(lián)反應。另有研究發(fā)現(xiàn)，導致ARDS的原因是機體產(chǎn)生過度的免疫反應，肺上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)廣泛而嚴重的損傷，最終引起ARDS的病理改變[3]。本課題組前期研究使用糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)干預脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠腸道微生物群發(fā)生明顯紊亂，采用FMT干預后腸道菌群紊亂得到糾正，肺損傷得到明顯改善[4-5]，但腸道菌群改善ALI/ARDS的具體介質(zhì)和機制尚不明確。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是腸道微生物群產(chǎn)生的最豐富和最重要的代謝產(chǎn)物之一，被認為是影響炎癥和免疫調(diào)節(jié)的代謝物[6]，其中乙酸、丙酸、丁酸占比最高，達90%～95%，三者比例約為3∶1∶1[7]。已有少量國內(nèi)外研究探討了乙酸、丙酸、丁酸對ALI/ARDS模型的影響及其機制，但三種主要SCFAs合用對ARDS模型影響的相關研究少見。本研究通過腸道內(nèi)補充三種SCFAs(乙酸∶丙酸∶丁酸=3∶1∶1)對LPS誘導的ARDS大鼠模型進行干預，探討SCFAs對ARDS的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 脂多糖、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉(美國S i g m a 公司)；腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢科鹿生物科技有限責任公司)；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) p65、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)抗體(美國CST公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(英國Abcam公司)；閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1，ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)抗體(英國Abcam公司)。手持血氣分析儀(美國雅培公司)；正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠20只，6～8周齡，體重(200±20) g，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心[動物許可證號：SYXK(川)2018-065]，適應性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(201903-85)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.3 實驗分組及ARDS大鼠模型構建 將20只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、低劑量SCFAs組與高劑量SCFAs組，每組5只。低劑量SCFAs組給予乙酸鈉300 mg/kg、丙酸鈉100 mg/kg、丁酸鈉100 mg/kg進行灌胃，高劑量SCFAs組給予乙酸鈉600 mg/kg、丙酸鈉200 mg/kg、丁酸鈉200 mg/kg進行灌胃，對照組、模型組分別給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。干預完成后開始造模，模型組、低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組大鼠通過氣管內(nèi)灌注LPS(5 mg/kg)建立ARDS模型，對照組大鼠氣管內(nèi)灌注等量生理鹽水，造模后12 h麻醉大鼠并進行取材。

1.3.1 大鼠動脈血氧分壓(PaO2)檢測 采用動脈采血針采集大鼠腹主動脈血1 ml，于手持血氣分析儀上檢測PaO2。

1.3.2 ELISA法檢測血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-6、IL-10的濃度 抽取大鼠腹主動脈血5 ml，3000 r/min離心15 min，取上清，于-70 ℃冰箱凍存待測。解剖大鼠胸部和頸部，結扎氣管和右側(cè)肺葉，用18G氣管插管插入氣管上端灌洗左肺，以生理鹽水5 ml反復灌洗3遍，按上述方法離心后取上清于-70 ℃冰箱凍存待測。按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測血清及BALF中TNF-α、IL-6、IL-10的濃度。

1.3.3 肺濕/干重比(W/D)測定 取出完整右肺，無菌濾紙吸干表面水分和血漬，用精密電子秤稱量濕重(W)，然后將肺組織置于烘箱內(nèi)烘烤72 h左右至完全脫水，取出稱量干重(D)，計算W/D，評價肺水腫程度。

1.3.4 HE染色觀察肺組織病理變化并進行肺損傷病理評分 取左上肺組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作5 μm切片，行HE染色觀察肺組織病理變化并進行肺損傷病理評分。依照Murao等[8]的方法進行評分，標準如下：(1)局灶性肺泡膜增厚；(2)毛細血管充血；(3)肺泡內(nèi)出血；(4)間質(zhì)中性粒細胞浸潤；(5)肺泡內(nèi)中性粒細胞浸潤。根據(jù)無損傷(0分)、輕度(1分)、中度(2分)或重度(3分)進行評分。每只大鼠隨機選取5個高倍視野，以各項評分總和的平均值作為每例樣本的肺損傷病理評分。

1.3.5 Western blotting檢測肺組織中JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達 取左下肺組織，用預冷的PBS漂洗2～3次，加入組織蛋白提取試劑徹底勻漿，冰上裂解，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA法測定蛋白濃度。上樣行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入JNK(1∶3000)、p-JNK(1∶500)，ERK(1∶3000)、p-ERK(1∶1000)、p38 M APK(1∶3000)、p-p38 M APK(1∶500)、NF-κB p65(1∶3000)、p-NF-κB p65(1∶500)、GAPDH(1∶10 000)一抗4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，經(jīng)曝光、顯影、定影，將膠片進行掃描存檔，采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目的條帶的灰度值。

1.3.6 免疫組化檢測結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達 取大鼠回腸末端至盲腸上方5 cm處的結腸組織，于4%中性甲醛溶液中固定24 h，制作石蠟切片，然后脫蠟至水、抗原修復、PBS洗滌，3% H2O2室溫孵育，加入ZO-1(1∶150)、Occludin(1∶100)一抗4 ℃孵育過夜，次日加入二抗工作液(1∶200)37 ℃水浴鍋孵育30 min，DAB顯色，蘇木精染核，脫水、封片，于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)進行半定量分析，每張切片隨機選取3個視野，測量并記錄每個視野陽性染色的積分光密度值(IOD)，取平均值作為每個樣本ZO-1、Occludin的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時進一步兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠PaO2和肺W/D比較 與對照組比較，模型組大鼠PaO2明顯降低[(56.40±2.61) mmHgvs. (81.80±2.77) mmHg，P＜0.05]，肺W/D升高(5.20±0.11vs. 4.23±0.05，P＜0.05)；與模型組比較，低、高劑量SCFA s組大鼠PaO2升高[(64.80±2.39) mmHg、(72.80±2.59) mmHg]，肺W/D降低(4.79±0.04、4.60±0.03)，且高劑量SCFAs組PaO2高于低劑量SCFAs組，肺W/D低于低劑量SCFAs組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化及肺損傷病理評分比較 HE染色結果顯示，對照組肺泡結構完整，無明顯肺泡間隔增厚、充血、水腫、中性粒細胞浸潤；模型組肺泡結構破壞嚴重，肺泡間隔明顯增厚、斷裂，可見出血、水腫，間質(zhì)及肺泡內(nèi)大量中性粒細胞浸潤。與模型組比較，低、高劑量SCFAs干預后肺泡結構破壞減輕，肺泡間隔增厚、出血、水腫減輕，中性粒細胞浸潤明顯減少，且高劑量SCFAs組較低劑量SCFAs組肺組織病理改善更明顯(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE ×200)Flg.1 Pathological changes of lung tissue in each group of rats A. 對照組；B. 模型組；C. 低劑量SCFAs組；D. 高劑量SCFAs組

與對照組比較，模型組肺損傷病理評分升高[(10.09±0.54)分vs. (2.33±0.42)分，P＜0.05]；與模型組比較，低、高劑量SCFAs組肺損傷病理評分降低[(7.40±0.92)分、(4.47±0.31)分]，且高劑量SCFAs組肺損傷病理評分低于低劑量SCFAs組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織中JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較 Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明顯增高(P＜0.05)；與模型組比較，低、高劑量SCFAs組大鼠肺組織中p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，且高劑量SCFAs組上述各指標均低于低劑量SCFAs組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織中JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較(n=3)Flg.2 Comparison of the relative expression levels of JNK, p-JNK, ERK, p-ERK, p38 MAPK, p-p38 MAPK, NF-κB p65 and p-NF-κB p65 protein in lung tissues of rats in each group (n=3)

2.4 各組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較 ELISA法檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6、IL-10濃度明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，低、高劑量SCFAs組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6濃度明顯下降，IL-10濃度進一步升高，且高劑量SCFAs組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6濃度低于低劑量SCFAs組，IL-10濃度高于低劑量SCFAs組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/ml, ±s, n=3)Tab.1 Comparison of the concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in serum and BALF of rats in each group (pg/ml, ±s, n=3)

表1 各組大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/ml, ±s, n=3)Tab.1 Comparison of the concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in serum and BALF of rats in each group (pg/ml, ±s, n=3)

BALF. 支氣管肺泡灌洗液；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；IL-6. 白細胞介素-6；IL-10. 白細胞介素-10；SCFAs. 短鏈脂肪酸；與對照組比較，(1)P＜0.05；與模型組比較，(2)P＜0.05；與低劑量SCFAs組比較，(3)P＜0.05

組別 血清 BALF TNF-α IL-6 IL-10 TNF-α IL-6 IL-10對照組 30.06±4.12 25.06±2.29 12.91±3.55 18.73±4.03 10.27±2.29 5.66±1.58模型組 123.27±10.61(1) 98.91±14.10(1) 26.15±6.27(1) 69.51±3.10(1) 53.09±2.98(1) 13.49±2.85(1)低劑量SCFAs組 79.53±8.13(1)(2) 77.81±5.34(1)(2) 54.27±8.33(1)(2) 55.44±6.3(1)(2) 43.14±3.07(1)(2) 24.90±3.94(1)(2)高劑量SCFAs組 39.68±4.23(2)(3) 38.59±4.99(2)(3) 74.21±3.42(1)(2)(3) 23.98±2.83(2)(3) 18.76±3.99(1)(2)(3) 32.52±1.5(1)(2)(3)

2.5 各組大鼠結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin相對表達量比較 免疫組化半定量分析結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠結腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，低、高劑量SCFAs組大鼠結腸組織中ZO-1、Occludin蛋白相對表達量增高，且高劑量SCFAs組上述各指標均高于低劑量SCFAs組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin相對表達量比較(IHC ×200，n=3)Flg.3 Comparison of the relative expression levels of tight junction protein ZO-1 and Occludin in colon tissue of rats in each group(IHC ×200, n=3)

3 討 論

SCFAs是腸道微生物群的重要代謝產(chǎn)物和信息分子[9]，主要由腸道菌群發(fā)酵不被消化吸收的膳食纖維產(chǎn)生，為鏈長1～6個碳原子的飽和脂肪酸。SCFAs可刺激共生細菌的生長和活性，調(diào)節(jié)腸道屏障功能，促進免疫并抑制腸道和其他器官的炎癥反應，這些功能由多種機制介導，包括組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)信號傳導等[10]。ARDS的主要發(fā)病機制是細胞因子風暴引起的全身性炎癥反應，其發(fā)病率和病死率均較高，而新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)大流行導致ARDS患者增多，但目前仍缺乏有效的藥物治療手段。最新研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者糞便中SCFAs含量明顯降低，且其含量與疾病嚴重程度和機體炎性因子水平呈負相關[11]，進一步表明了SCFAs與疾病和炎癥相關。

MAPK信號通路可被LPS、前炎性因子等激活，在炎癥反應調(diào)節(jié)過程中起重要作用，該通路由JNK、p38 MAPK、ERK和ERK5等途徑組成，其中前三條途徑與炎癥密切相關，磷酸化后可調(diào)節(jié)下游產(chǎn)物的活性，影響炎性細胞的激活和炎性因子(如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等)的釋放，在調(diào)控ARDS炎性因子生成中起重要作用[12]。NF-κB信號通路的激活與炎癥反應的強度密切相關，是炎癥的中心介質(zhì)，在細菌LPS、電離輻射、活性氧(ROS)、細胞因子，以及病毒DNA、RNA[13]等的刺激誘導下，NF-κB磷酸化并發(fā)生核易位，與其同源DNA結合，激活參與宿主免疫、炎癥、細胞增殖和凋亡的各種基因的轉(zhuǎn)錄[14]，包括多種細胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α等)、趨化因子和黏附分子等[15]，而這些下游介質(zhì)又可進一步激活NF-κB信號通路，因此NF-κB信號通路在細胞因子風暴發(fā)生中起關鍵作用，而細胞因子風暴被認為是引起ARDS的重要原因。因此，抑制上述信號通路可能是ARDS的有效治療靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs對免疫細胞和內(nèi)皮細胞的NF-κB活化和MAPK信號通路具有調(diào)節(jié)作用[16]，并通過IL-10等促進局部和全身的抗炎反應[17]。SCFAs發(fā)揮抗炎作用部分是通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達而增強腸上皮屏障功能，進而阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進入血液循環(huán)實現(xiàn)的；而腸屏障受損可能導致腸道細菌及毒素移位，使促炎因子大量釋放，加重ARDS及全身炎癥反應等。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織中p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯升高，MAPK和NF-κB信號通路被激活，下游促炎因子TNF-α、IL-6濃度升高，導致大鼠肺組織損傷病理評分明顯增高，PaO2降低，肺W/D升高，同步檢測結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達減少，提示ARDS大鼠存在腸屏障功能受損；而補充低、高劑量SCFAs后，MAPK和NF-κB信號通路相關蛋白磷酸化水平降低，下游炎性因子TNF-α、IL-6濃度降低，抗炎因子IL-10濃度升高，PaO2上升，肺W/D、肺組織損傷病理評分降低，同時結腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達增加，腸黏膜屏障得以修復，且SCFAs高劑量組較低劑量組各項指標改善更明顯，提示SCFAs的抗炎作用可能在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

近年來，隨著對腸道微生物及其代謝產(chǎn)物的深入研究，越來越多的證據(jù)表明，SCFAs可影響機體的免疫、炎癥與代謝過程，被認為是腸道微生物與免疫系統(tǒng)之間交流的介質(zhì)。SCFAs的主要產(chǎn)生部位在結腸，是結腸細胞的主要能量來源，也有部分SCFAs從腸道轉(zhuǎn)移到肝臟的門靜脈循環(huán)，僅小部分的SCFAs通過血液循環(huán)到達全身，但這些血液中的SCFAs被認為足以影響全身的宿主細胞[18]。SCFAs無明顯毒副作用，通過補充SCFAs調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)與炎癥反應，改善ARDS甚至更多疾病是一種發(fā)展前景極佳的治療手段。本研究結果顯示，SCFAs可改善LPS誘導的大鼠ARDS，且SCFAs高劑量組較低劑量組改善更明顯，然而具體的劑量-效應關系仍需進一步探索，以明確最大效能時的藥物劑量，有條件時可同步檢測腸道或血液中主要SCFAs的含量。SCFAs的作用機制復雜多樣，尚不完全明確，可能涉及多種信號通路的調(diào)控，本研究僅對MAPK、NF-κB信號通路進行探討，且通過三種混合SCFAs對ARDS大鼠進行干預，其中的機制錯綜復雜，乙酸、丙酸、丁酸各自的作用通路可能有所區(qū)別或存在交叉協(xié)同。此外，SCFAs主要通過腸道間接激活全身免疫系統(tǒng)還是通過吸收入血到達外周器官發(fā)揮抗炎作用尚不明確。以上問題均有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究結果顯示SCFAs可改善LPS所致大鼠ARDS，其機制可能與通過維持腸道屏障功能、抑制MAPK和NF-κB信號通路蛋白的磷酸化，從而減少下游致炎因子的釋放、增加抗炎因子的生成有關。