長鏈非編碼RNA在動脈粥樣硬化“損傷-應答”中的作用機制研究進展

陳宇恒，王正龍

遵義醫科大學附屬醫院心血管內科，貴州遵義 563000

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發生發展機制可簡要概括為“損傷-應答”學說，即多因素導致血管內皮細胞(vascular endothelia cell，VEC)功能失調，單核-巨噬細胞(Mo-Mφ)及淋巴細胞介導動脈內膜炎癥，導致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)遷移增殖及泡沫細胞沉積，最終以斑塊破裂、鈣化或纖維化為結局[1-3]。盡管目前針對AS的治療策略已明顯改善了患者的預后，但長期用藥、藥物不耐受及用藥禁忌等問題的存在，使AS的合理、規范化治療仍面臨一定挑戰[4-5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類核酸序列長度大于200 bp的非編碼RNA，因其缺乏開放閱讀框，不通過編碼蛋白調控生物體機能[6]，曾被認為是人類基因組中的“噪點”及“暗物質”。隨著高通量測序與蛋白組學的發展，人們發現lncRNA可在轉錄、翻譯、翻譯后修飾等多個層面影響疾病的發生發展過程[7-10]，且目前已有lncRNA參與“損傷-應答”調控流程的相關報道。因此，本文匯總了NEXN-AS1、MANTIS、LeXis、MALAT1等lncRNA調控“損傷-應答”的機制，旨在為進一步明確AS的發病機制、完善AS的診療提供參考。

1 LncRNA NEXN-AS1的抗炎效應與“損傷-應答”

1.1 NEXN與心血管病 NEXN(nexilin-F-actinbinding-protein)在心肌細胞中作為T管的核心，與Jph2(junctional protein junctophilin 2)、RyR2(type 2 reynoldin receptor)共定位于心肌肌質網，組成膜連接復合體以調控心肌細胞膜的鈣電流及胞質內的鈣瞬變[11]，但在VSMC、VEC、Mo-Mφ細胞中則作為肌絲結合蛋白，并調節細胞的黏附及遷移[12]。近年來研究發現，NEXN在人、鼠等多個物種間高度保守，且與多種心血管疾病存在較強的關聯，在小鼠模型中，NEXN已被證實參與了AS、擴張型心肌病的病理生理過程[11,13]；一項大規模的多中心隨機對照臨床試驗也提示NEXN參與了部分擴張型心肌病的進展[14]；此外，冠心病患者外周血、病灶中NEXN的表達水平也低于健康人[12]。

1.2 LncRNA NEXN-AS1調控“損傷-應答”的機制 2019年，Hu等[12]報道，NEXN-AS1(NEXN antisense RNA 1)作為NEXN的反義RNA與NEXN共定位于1p31.1。

Hu等[12]通過高脂喂養ApoE-/-小鼠模擬脂代謝紊亂，通過LPS處理VEC/VSMC/Mφ模擬血管內炎癥，并基于此探討NEXN-AS1對動脈粥樣硬化“損傷-應答”的調控機制，發現NEXN-AS1的5'端1～1000 nt序列可與組蛋白的重塑劑——溴基結構域相鄰的鋅指結構域蛋白1A (bromodomain adjacent to zinc finger domain 1A，BAZ1A)交聯，進而使染色質由致密變得疏松，上調NEXN的表達。此外，該研究還發現，作為NEXN-AS1在表觀遺傳性狀調控上的映射，VEC的Toll樣受體4/核因子κB(Toll like receptor-4/nucler factor-κB，TLR-4/NF-κB)通路被下調，單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukins-6，IL-6)、細胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管黏附分子-1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)的表達水平降低，最終，Mo-Mφ的趨化及VSMC的增殖被抑制，炎癥反應對VEC的損傷作用減輕。總之，NEXN-AS1的下游效應幾乎涉及了“損傷-應答”反應的每一個階段，詳細過程見圖1。

1.3 NEXN-AS1/NEXN與細胞焦亡 細胞焦亡(pyroptosis)是有別于細胞凋亡、自噬性死亡的一種程序性死亡方式，以半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、消皮素D(gasdermin D，GSDMD)、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)、白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)作為分子標志[15]，幾乎涉及“損傷-應答”的各個環節：VEC焦亡促進了Mo-Mφ在血管內膜的募集，巨噬細胞焦亡加速了AS壞死核心的形成[16]，VSMC焦亡則削弱了斑塊纖維帽的厚度，可促進不穩定斑塊的形成[17]。

Wu 等[18]使用不同濃度的阿托伐他汀處理VEC，發現NEXN-AS1/NEXN的表達呈劑量依賴方式增加，而細胞焦亡的標志分子caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β等則被抑制，NEXNAS1/NEXN被沉默后，阿托伐他汀的抗焦亡效應消失，提示他汀的內皮保護作用與lncRNA相關，為lncRNA作為AS的干預靶點提供了證據。

1.4 NEXN-AS1/NEXN的應用前景 有研究采用基因微陣列分析正常及AS病變的主動脈組織，結果發現NEXN-AS1/NEXN在粥樣斑塊中的表達水平與病變程度呈負相關[12]。此外，人VEC NEXNAS1/NEXN沉默后，caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β的表達明顯增高，且小鼠體內NEXN-AS1被沉默后，可明顯加速AS的進展[18]。就機制來說，NEXN-AS1廣泛參與了血管內炎癥及細胞焦亡的調控(圖1)，就表觀性狀來說，NEXN-AS1所調控的NEXN涉及AS在內的多種心血管疾病，提示NEXNAS1或可成為治療疑難心血管疾病的新靶點。

圖1 NEXN-AS1通過NENX抑制“損傷-應答”的機制Fig.1 NEXN-AS1 inhibits the progression of "Injury-Response"

2 LncRNA MANTIS的他汀樣作用與“損傷-應答”

2.1 LncRNA MANTIS概述 2017年，Leisegang等[19]報道了lncRNA MANTIS，其基因位于2p13.3，為Anxa4的反義內含子，在人與小鼠間高度保守，與VEC的增殖、分化密切相關。MANTIS受H3K4賴氨酸特異性去甲基化酶5(JARID1B)、肌肉細胞特異性增強因子2A(myocte specific-enhancer factor-2A，MEF2A)的負向調控及Krüppel樣轉錄因子2(KLF2)/KLF4、他汀類藥物的正向調控，廣泛表達于各種內皮細胞[19-20]；此外，在食蟹猴的斑塊消退期可檢測到MANTIS的高表達，而在人頸動脈粥樣斑塊內MANTIS則呈低表達[19]。

2.2 LncRNA MANTIS與SOX18/SMAD6/COUP-TFⅡ在血管內皮生長、分化中的作用 目前認為，性別決定區Y框蛋白18(sex determining region Y-box 18，SOX18)、Smad同源物6(SMAD6)、雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ(chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor Ⅱ，COUP-TF Ⅱ)在VEC的生長、分化過程中起著至關重要的作用[21-23]。當敲除MANTIS后，SOX18、SMAD6、COUP-TF Ⅱ的表達下調，VEC的出芽、增殖、遷移能力受阻；此外，MANTIS不僅促進了SOX18、SMAD6、COUPTF Ⅱ的表達，還促進了三者間的功能整合[19]。

MANTIS的外顯子3為一段含Alu元件的序列，對SOX18、SMAD6、COUP-TF Ⅱ的功能整合及穩定染色質重構復合物核心催化亞基(brahma related gene-1，BRG-1)/BAF155復合物至關重要：在球體生長試驗中，敲除VEC的MANTIS后，單純過表達SOX18、SMAD6、COUP-TFⅡ不能使內皮的發芽正常化，而過表達Alu元件則可抵消MANTIS敲除的效應，提示MANTIS的生物學功能依賴于其含Alu元件的序列[19]。此外，MANTIS的Alu元件還可通過抑制ICAM-1的表達來抑制Mo-Mφ在血管內膜的黏附、激活，提示其或可抑制由各種“損傷”引起的Mo-Mφ“應答”[20]。

2.3 LncRNA MANTIS通過SWI/SNF調控內皮功能的機制 SWI/SNF復合物(SWItch/sucrose nonfermentable complex)是廣泛存在于哺乳動物細胞核中的ATP依賴的染色質重塑劑，依托乙酰化組蛋白H3K27定位于染色質[24]；目前認為SWI/SNF復合物以BAF47/155/170(SWI/SNF complex 47/155/170 kD subunit)、BRG-1為分子核心[25]，通過BRG-1提供ATP酶活性，以滑動、消除組蛋白的方式創建DNA區域，實現基因表達的調控[24,26]。

LncRNA MANTIS可穩定BRG-1/BAF155復合物，促進SWI/SNF復合物介導的染色質重塑，通過提高RNA聚合酶Ⅱ的轉錄活性來提高SOX18、SMAD6、COUP-TF Ⅱ的表達水平，促進VEC的增殖分化及功能整合[19](圖2)。

圖2 LncRNA MANTIS對內皮細胞生長、分化的促進作用Fig.2 Effect of lncRNA MANTIS promotes endothelial growth and differentiation

2.4 LncRNA MANTIS與他汀的多效性 盡管目前尚無lncRNA MANTIS直接參與AS發生發展的報道，但作為抗AS基石之一的他汀類藥物可通過增強MANTIS啟動子活性、誘導KLF2/KLF4、抑制MEF2A等多種途徑調控MANTIS的表達[20]，且在MANTIS敲除的內皮細胞中，阿托伐他汀的促血管再生、調控血栓調節蛋白轉錄譜、增加端粒酶活性等抗AS效應均被抑制，提示lncRNA MANTIS或可抑制AS進展，并成為抗AS治療的潛在靶點[20]。

3 LncRNA LeXis的調脂效應與“損傷-應答”

3.1 LncRNA LeXis概述 LncRNA LeXis(liverexpressed LXR-induced sequence)又名CT70，基因定位于9p31.1，由Sallam等[27]于2017年在探究肝X受體(liver X receptor，LXR)、固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)調控膽固醇代謝的過程中發現并報道，命名為LeXis，其在人與小鼠間均高度保守。

3.2 LncRNA LeXis的調脂效應與SREBP SREBP本身作為調控膽固醇生物合成的重要分子，在機體固醇含量豐富時被抑制，反饋性下調膽固醇的生物合成途徑[28-29]。LeXis通過促進膽固醇流出肝臟，并抑制膽固醇生物合成的方式調控膽固醇穩態，而LeXis的調脂效應不同于他汀、前蛋白轉化酶枯草素/Kexin9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)抑制劑的藥理作用，不影響肝功能，無內質網應激，也無需低密度脂蛋白受體(LDL-R)的參與，提示LeXis可能干預脂代謝紊亂所引起的“損傷”，進而抑制下游的“應答”[4,27]。

Sallam等[27]于小鼠肝細胞過表達LeXis后，提取核蛋白行質譜分析時發現了含RNA結合結構域、亮氨酸拉鏈結構域的核糖核蛋白RALY，其本身是小鼠肝臟膽固醇生物合成基因的轉錄輔助因子(transcriptional cofactor)激活劑，而LeXis正是通過與RALY交聯，減少RNA聚合酶Ⅱ在Srebp2等靶基因啟動子上的起始轉錄，進而降低SREBP2、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶、法尼基二磷酸法尼基轉移酶1(FDFT1)的表達，最終使膽固醇的生物合成明顯減少(圖3)。

圖3 LncRNA LeXis對脂代謝的調節機制Fig.3 Regulatory mechanism of lncRNA LeXis on lipid metabolism

3.3 LncRNA LeXis的應用前景 家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，FH)是以血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯升高為特征的一種常染色體遺傳病，多數FH患者因涉及Ldlr、Apob的突變，即使高強度他汀、PCSK-9抑制劑治療也無法控制LDL-C達到指南的推薦目標[4,30-31]。

Tontonoz等[31]將含LeXis的AAV-8質粒轉染入LDL-R-/-FH小鼠，發現LeXis處理后的小鼠總膽固醇及三酰甘油水平明顯降低，且AS病變程度明顯減輕(圖3)，提示LeXis可用于治療FH等難治性高脂血癥，強化AS或冠心病的各級預防，改善此類患者的預后，也再次為lncRNA可作為治療靶點提供了證據。

4 LncRNA MALAT1的免疫調控與“損傷-應答”

4.1 LncRNA MAL AT1概述 肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)基因位于11q13.1，序列長8 kb，在人與小鼠間高度保守。初始MALAT1在其多聚腺苷酸上游可形成類似tRNA的三葉草結構，由RNA酶P (RNase P)識別、剪切形成兩個轉錄本，其中的5'端側即為7000 nt的成熟MALAT1，而3'端側經RNase Z、CCA添加酶修飾后進入胞質，形成MALAT1-associated small cytoplasmic RNA(mascRNA)[32](圖4)。

圖4 LncRNA MALAT1的加工過程及下游靶分子Fig.4 Processing of the lncRNA MALAT1 and its downstream target molecules

4.2 LncRNA MAL AT1的免疫活性調節機制MALAT1通過與巨噬細胞、樹突狀細胞(dendrite cell，DC)中的NF-κB結合而沉默NF-κB，調節巨噬細胞與DC的天然免疫應答，調控血管內膜炎癥[33]。T細胞在粥樣斑塊中占白細胞的25%～38%[34]，提示T細胞在“損傷-應答”調控中占有重要地位，而MALAT1可通過抑制DC胞內的NF-κB與CD80啟動子結合，下調DC膜表面CD80的表達[35]，從而削弱初始T細胞的激活，進一步減弱各種“損傷”因素引起的Mo-Mφ、DC-T細胞“應答”。

M A L A T 1 的另一部分抗炎機制依賴于mascRNA：在MALAT1+/-骨髓源性巨噬細胞株(bone marrow macrophage，BMDM)的趨化、促炎癥因子(TNF、NOS2、CCL2、CCL7)水平明顯高于野生型BMDM的基礎上，利用鎖核酸修飾的反義寡核苷酸(lock nucleic acid modified antisense oligonucleotides，L N A-A S O)選擇性耗竭M A L AT 1+/+B M D M s 的mascRNA后，其TNF、IL-6的表達水平可更進一步升高，提示mascRNA也參與了免疫炎癥的調控，但目前尚缺乏其機制的研究報道[36]。

MALAT1還可通過miR-503的分子海綿效應發揮對“損傷-應答”的負調控作用：Cremer等[37]、Yan等[38]分析了MALAT1+/-小鼠與野生型小鼠的差異性microRNA，發現包括miR-503在內的多種microRNA在轉錄水平不變的背景下含量增加，而抗miR-503可顯著降低TNF-α介導的VEC表型轉換，模擬MALAT1的內皮保護效應。

4.3 LncRNA MALAT1與AS的關聯 Gast等[36]發現，即使在正常飲食喂養下，MALAT1+/-ApoE-/-小鼠的AS進展也快于ApeE-/-小鼠。Cremer等[37]對MALAT1+/+ApoE-/-小鼠行MALAT1-/-ApoE-/-骨髓移植，發現可解除MALAT1的AS保護效應，粥樣斑塊也更趨向發展為不穩定斑塊。有臨床研究也發現粥樣斑塊內的總MALAT1水平或與患者心腦血管事件的發生率呈負相關，提示MALAT1可抑制AS的進展[36-37]。

5 其他參與調控“損傷-應答”的lncRNA

5.1 LncRNA MeXis通過ABCA1調控“損傷-應答”的機制 MeXis (macrophage-expressed LXR-induced sequence)由Sallam等[39]于2018年報道，在人與小鼠間高度保守，可被LXR激活，通過DDX17-ABCA1軸進行調脂，抑制脂代謝紊亂引起的“損傷”，進而抑制下游的“應答”。

MeXis可協助DDX17(一種核受體輔助因子)與LXR在Abca1啟動子上結合，激活ATP結合盒轉運元件A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)的表達，而ABCA1則通過促進游離膽固醇流向Apo A-1，加速HDL-C的生成，促進巨噬細胞內的脂質流出[40]。

在動物模型中，MeXis-/-LDL-R-/-小鼠無論是AS進展還是易損斑塊的發生率均高于LDL-R-/-小鼠，且一項基于1000個基因組的冠脈疾病全基因組關聯meta分析結果發現，人MeXis單核苷酸多態性與冠心病存在明顯相關性，提示MeXis可抑制AS的進展[41]。

5.2 LncRNA SNGH-12促進DNA修復調控“損傷-應答”的機制 氧化應激可致DNA損傷，加速VEC的功能障礙，繼而促進“損傷-應答”[42]，小核仁宿主基因-12(small nucleolar host gene-12，SNHG-12)在進化上較為保守，可通過DNA依賴性蛋白激酶(DNAdependent protein kinase，DNA-PK)/DNA-PKcs-Ku70/Ku80途徑，輔助VEC的DNA損傷修復[43]。

大多數哺乳動物以非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)的方式修復DNA雙鏈斷裂：通過Ku70/Ku80異二聚體快速識別斷裂的DNA末端并保護其免受核酸酶水解，隨后DNA-PK的催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)提供激酶活性，磷酸化大量與之重疊的底物，促進有效而準確的DNA修復，通過抑制“損傷”的進展，繼而抑制下游的“應答”[44-46]。

LncRNA SNHG-12可與DNA-PK交聯，促進DNA-PK/DNA-PKcs與Ku70/Ku80的相互作用，提高NHEJ的效率，抑制氧化應激，而敲除SNHG-12可加速VEC的衰老，促進AS進展[43]。

5.3 LncRNA MARRS抑制胞葬作用調節“損傷-應答”的機制 巨噬細胞相關動脈粥樣硬化基因序列(macrophage-associated atherosclerosis lncRNA sequence，MARRS)由Simion等[47]于2020年報道，可通過調節HuR(一種RNA結合蛋白，可結合凋亡相關基因的mRNA，抑制細胞凋亡)而加速巨噬細胞的凋亡，抑制斑塊內的胞葬作用，促進“損傷-應答”的進展。

胞葬作用是細胞在發生進一步壞死之前清除凋亡細胞的過程[48]。在斑塊早期，VSMC及巨噬細胞的凋亡可被胞葬作用清除，但隨著AS進展，巨噬細胞凋亡的累積使胞葬作用不足以維持正常的血管內膜結構；最終，斑塊內壞死不斷加重，斑塊性質轉變為易損斑塊[49]。

LncRNA MARRS可通過沉默HuR，促進p53、p27、caspase-8和caspase-9表達，增加巨噬細胞的凋亡，從而削弱巨噬細胞的胞葬作用，加速AS的進展[47]。

5.4 其他調控“損傷-應答”的LncRNA

5.4.1 促進“損傷-應答”的lncRNA

5.4.1.1 LncRNA VINAS LncRNA VINAS (Vascular INflammation and Atherosclerosis lncRNA Sequence)與人DEPDC4(DEP domain containing 4)同源，在VEC/VSMC/Mo-Mφ中均有表達，但主要表達于VEC[50]，可通過NF-κB和MAPK通路調節血管內炎癥，敲低VINAS可減少VEC/VSMC/Mo-Mφ源的MCP-1、TNF-α、IL-1β水平，抑制AS的進展，且人DEPDC4的敲低也可復制VINAS的抗炎效應。

5.4.1.2 LncRNA MEG3 LncRNA MEG3(maternally expressed gene 3)在人、鼠間保守，并表達于多種組織[51]；MEG3可充當miR-223(一種重要的抗炎miRNA[52])的分子海綿，以增加NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck- like protein containing a CARD，ASC)、cleaved caspase-1及GSDMD的表達，促進VEC的焦亡并加速AS進展[53]，而具有抗AS效應的褪黑素則可阻斷MEG3/miR-223/NLRP3軸以緩解MEG引起的VEC焦亡，提示lncRNA MEG3或可作為AS的干預靶點[53]。

5.4.1.3 LncRNA Kcnq1ot1 KCNQ1重疊轉錄本1(kcnq1 overlapping transcript 1，Kcnq1ot1)是Kcnq1基因座上的一種印記反義lncRNA[54]，在人與小鼠間保守[55]。lncRNA kcnq1qt1通過競爭性結合miR-452-3p以增強組蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)的表達，進而減少ABCA1的表達，使巨噬細胞的膽固醇流出受抑制，最終加重脂代謝紊亂；kcnq1qt1敲除則可抑制人單核細胞白血病細胞系(human monocytic leukemia cell line，THP1)源巨噬細胞的脂質積聚，并明顯減緩ApoE-/-小鼠的AS進展[54]。

5.4.2 抑制“損傷-應答”的lncRNA

5.4.2.1 LncRNA NORAD DNA損傷激活的非編碼RNA(non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD)是一種在哺乳動物高度保守，并參與調節基因組穩定性的lncRNA[56]，可通過抑制NF-κB、p53-p21及IL-8來調控細胞周期、血管內炎癥，并發揮VEC的保護效應[57]。NORAD敲除后，ox-LDL誘導的活性氧、NF-κB及其下游的ICAM、VCAM、IL-8增加，加速了ApoE-/-小鼠的AS進展[57]。

5.4.2.2 LncRNA PEBP1P2 LncRNA PEBP1P2是VSMC表型轉化的調節因子，不僅可直接與細胞周期依賴的蛋白激酶9(cyclin-dependent kinase 9，CDK9)結合，下調p38-MAPK通路的c-Jun、p38磷酸化水平以拮抗AS進展，還可抑制血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)誘導的VSMC表型轉換[58]。基于PEBP1P2可直接結合CDK9而抑制VSMC增殖、遷移的特性，提示其可能成為晚期AS的治療靶點。

5.4.2.3 LncRNA-FA2H-2 LncRNA-FA2H-2的抗AS效應主要依賴于混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)，后者可引起哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR)/蛋白激酶B(protein kinase B)依賴的VEC/VSMC自噬缺陷，促進MCP-1、VCAM-1、IL-6的表達[59]，而lncRNA-FA2H-2的-750～387序列可與MLKL的啟動子區域結合，通過下調MLKL的表達而緩解自噬缺陷及炎癥反應，減緩“損傷-應答”的進展[59]。其余參與“損傷-應答”調控的lncRNA見表1。

表1 促進及抑制“損傷-應答”的lncRNATab.1 LncRNAs that accelerated and inhibit the "Injury-Response" process

6 總結與展望

NEXN-AS1、MANTIS、LeXis、MALAT1等lncRNA高度保守，具備強大的表觀遺傳調控能力，并參與調控“損傷-應答”中的脂質沉積、血管內膜炎癥、細胞增殖與凋亡等過程，因此，lncRNA可能成為AS新的診療靶點。但目前仍存在一些爭議，如腫瘤相關lncRNA用于治療是否會增高腫瘤發病率，lncRNA促進VEC增殖是否會加速支架置入術后的支架內再狹窄，以及lncRNA是否可改善AS的遠期預后等。希望心血管領域的科研人員更加重視lncRNA的地位，早日解決上述問題，以實現lncRNA的臨床應用，改變目前AS診療的窘境，最終使AS患者獲益。