功能代謝組學在生物醫藥領域中的應用

劉璟賢，張建永，李曉飛,3*

1遵義醫科大學基礎醫學院，貴州遵義 563000；2遵義醫科大學藥學院，貴州遵義 563000；3遵義醫科大學貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州遵義 563000

代謝組學作為系統生物學的重要組成之一，是繼蛋白質組學、轉錄組學后發展起來的圍繞機體代謝的新興組學，通過分析機體在不同干預條件下的差異代謝物，繼而發現背后的生物代謝機制。既往代謝組學與其他組學的整合多是通過獨立分析，再通過數理統計分析及生物信息學分析等方法尋求代謝組學發現的差異代謝物與其他組學發現的差異蛋白、基因之間的聯系，然而這種方法是建立在查閱文獻及推測的基礎上的，代謝物-蛋白-基因之間的上下游聯通關系尚未經生物學研究印證，同時代謝物與蛋白之間存在代謝酶的橋接，目前的多組學聯合分析也難以實現。功能代謝組學是繼代謝組學之后發展起來的研究策略和方法，其在代謝組學發現差異代謝物、預測差異代謝通路的基礎上，通過實驗對差異代謝物關聯的上游代謝酶、蛋白及基因進行驗證，是自下而上系統分析生物學病理生理現象的全新途徑，是對代謝組學的有力補充，也是加強代謝組學與其他組學溝通的有力手段。本文系統地介紹功能代謝組學的原理及采用的研究策略，并對其在生物醫藥研究中取得的系列成果和最新進展進行綜述，以為其發展和應用提供更多科學依據及參考。

1 概 況

1.1 代謝及代謝組學 代謝是一系列生物化學反應的集合，通過一系列代謝產物維持機體的正常生命活動，在生物體內發揮著重要作用。在該過程中，代謝產物可促進不同生理過程的物質交換并在生物體內合成能量，是機體代謝反應的關鍵前體及分解代謝反應的關鍵底物[1]。當機體受到內源性和外源性刺激時，一些內源性小分子代謝物可被擾動而發生改變。

代謝組學是繼蛋白質組學、轉錄組學后發展起來的圍繞機體代謝的新興組學，其研究對象是機體內分子量較小的內源性代謝物，如糖類、氨基酸、脂質和有機酸等。代謝組學通過檢測機體受到干擾后內源性代謝物的變化，從中找出與干擾相關的差異代謝物，同時結合生物信息學分析闡明代謝通路，繼而解析生物代謝機制[2]。目前，根據研究目的不同，代謝組學可劃分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學兩種類型。其中，非靶向代謝組學側重于發現，對分析的代謝物沒有偏向性，是對整個機體代謝組的比較；靶向代謝組學是非靶向代謝組學的深入，側重于精準，是一種預先建立假設的分析方法，用于分析已知的小分子代謝物，可達到精準定量，能更準確地挖掘出差異代謝物的精準變化。非靶向代謝組學是進行代謝組學研究的首選，在高通量分析生物體內代謝物方面具有明顯優勢[3]，靶向代謝組學是在非靶向代謝組學基礎上的進一步深入研究。

1.2 代謝組學研究技術及應用 目前，核磁共振技術(nuclear magnetic resonance，NMR)、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GCMS)和液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)是代謝組學研究的主要技術。其中NMR樣品需求量小、前處理簡單，是一種無損的多參數和動態監測技術，多用于廣譜代謝組學分析，但其靈敏度低、檢測通量小[4]。GC-MS重現性較好，分辨率及靈敏度較高，且具有系統自帶數據庫，可用于差異代謝物的鑒別，是目前檢測代謝物的一種重要方法并被廣泛使用，但對于揮發性較低的代謝產物需要繁瑣的衍生化處理且檢測通量不高[5]。LC-MS具有樣品前處理簡單、分析范圍廣、分離能力強、代謝物組覆蓋率廣等特點，可很好地彌補GC-MS的物質檢測偏向性和NMR的低靈敏度，是目前代謝組學研究主要使用的分析技術，但存在代謝物鑒定沒有數據庫等問題[6]。

近年來，代謝組學已被廣泛應用于生物醫藥研究中，對于發現機體病理生理過程及藥物干預過程中的關鍵代謝途徑和生物標志物具有獨特優勢，可用于輔助疾病的早期診斷以及疾病機制、藥物作用機制、靶點發現、毒效和毒理機制等方面的研究。目前大多數代謝組學研究仍聚焦于發現標志代謝物，通過生物信息學分析揭示其生化功能和相關機制，缺少對差異代謝物相關的酶、蛋白以及反應途徑功能的實驗驗證，缺少上下游的有機整合[1]。因此，在通過代謝組學獲取準確結果后，有必要對代謝物的上下游進行整合分析。

1.3 功能代謝組學 通過代謝組學對不同病理生理狀態下內源性代謝物進行精準表征，發現差異代謝物后，進一步通過實驗對代謝物及其變化前后的關聯酶、通路進行功能驗證，便形成了功能代謝組學。功能代謝組學由于整合了代謝物及其上下游的酶、基因和蛋白，可更好地闡釋代謝組學發現的生物學分子本質[1]，更全面地反映機體的狀態，從而為疾病的診斷、治療、藥效、毒效以及機制研究提供新的思路。

2 功能代謝組學的研究策略

2.1 基于代謝物功能的研究 基于代謝物功能的研究策略如圖1所示：首先通過代謝組學獲得差異代謝物，進一步篩選差異較大的關鍵代謝物，接下來圍繞關鍵代謝物的功能進行深入研究。通常在獲得關鍵代謝物后，可通過查閱文獻，獲取關鍵代謝物的功能。此時可采取兩種策略，一種是采用數理統計方法將關鍵代謝物含量與同時觀測到的疾病生理、生化指標進行關聯分析，通過相關分析獲取關鍵代謝物可能參與的主要功能；另一種是通過實驗驗證關鍵代謝物的功能在所研究的病理生理條件下的具體作用。這屬于功能代謝組學的初級研究，如Sun等[7]發現，茵陳蒿湯(YCHT)干預陽黃綜合征(Yang Huang syndrome，YHS)模型小鼠后，D-葡萄糖醛酸是關鍵的差異代謝物，進一步分析發現戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化途徑是關鍵的代謝途徑，且該途徑的上游調節蛋白尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UDP-ducuronosyltranskrase，UGT)與YHS的代謝標志物相關。有研究發現，UGT參與了內源性化合物如膽紅素的生物代謝，通過檢測小鼠血清生化指標膽紅素的變化，發現UGT可導致血清膽紅素含量增加，證實了YCHT通過戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化途徑影響膽紅素的含量，從而治療YHS。

圖1 基于代謝物功能的研究策略Fig.1 Research strategies based on metabolite function

進一步深入地開展功能代謝組學研究，采用的策略一般是通過體內外實驗，使用關鍵代謝物干預動物、離體器官、細胞等，結合分子生物學技術(如流式細胞術、Western blotting、RT-PCR等)驗證關鍵代謝物的生物學功能，從而揭示代謝物在病理生理狀態下的作用，從而為探討疾病發病機制及藥/毒理作用機制等提供科學依據。例如，有研究通過代謝組學分析發現，貝殼杉烷型二萜類化合物(parvifoline AA，PAA)可增加不同人肝癌細胞系(SMMC-7721、Huh7和HepG2細胞)中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量，進一步研究發現參與ROS生成的過氧化物酶Ⅰ和Ⅱ(Prxs-Ⅰ/Ⅱ)的表達升高，流式細胞術檢測發現ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可有效抑制PAA在人肝癌細胞中誘導的ROS累積[8]。有研究通過代謝組學分析發現，2型糖尿病患者血清中代謝物4-甲酚的濃度與疾病嚴重程度呈負相關；采用4-甲酚干預高脂喂養的小鼠發現，小鼠胰島β細胞陽性面積和密度增加，表明4-甲酚可促進胰島素的分泌；進一步采用RT-PCR檢測發現，4-甲酚可促進小鼠脂肪組織中激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)和patatin樣磷脂酶結構域2(patatin-like phospholipase，PNPLA2)的表達，增加胰腺相關基因編碼淀粉酶、血管內皮生長因子、腦源性神經營養因子、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和去沉默調控蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)基因的轉錄表達[9]。有研究通過代謝組學分析發現，黃芪多糖(APS)可改善高脂飲食(HFD)小鼠的代謝紊亂，其關鍵代謝物為2-羥基丁酸(2-hydroxybutyric acid，2-HB)；采用2-HB干預人HepG2細胞和小鼠胚胎成纖維3T3-L1細胞，Western blotting檢測發現2-HB能促進肝細胞HSL、三酰甘油脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)和羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CE1)的表達，并促進3T3-L1細胞中三酰甘油的釋放，提示2-HB可促進脂質降解[10]。

2.2 基于代謝物所在代謝途徑的研究 如圖2所示，通過代謝組學發現的差異代謝物可以表征生物體的病理生理狀態，同時差異代謝物所在的代謝通路也與病理生理狀態密切相關。除代謝物外，代謝通路中代謝物關聯的上下游的酶、基因等至關重要，因此通過探索代謝物所在代謝通路中的酶及基因變化可更全面地闡述代謝物的功能，這也是功能代謝組學的主要研究策略。目前采用的方法是通過體內外實驗使用酶的激活劑和抑制劑進行干預，或是敲除/過表達相關酶及基因的表達后，觀察體內外模型的代謝表型變化，同時采用分子生物學技術檢測代謝物關聯的酶和基因的功能進一步佐證。Zhao等[11]發現，雷公藤紅素降低了膽汁淤積患者血清膽汁酸的濃度，而SIRT1蛋白表達水平與膽汁酸濃度呈反比[12]，通過功能代謝組學方法，采用小鼠干預實驗及細胞實驗，發現雷公藤紅素可抑制膽汁酸濃度的增加，逆轉肝臟SIRT1蛋白表達的下降，進一步通過敲除法尼醇X受體(farsenoid-X receptor，FXR)和SIRT1抑制劑實驗證實了雷公藤的這種保護作用與激活SIRT1-FXR信號通路有關。Wang等[13]建立了長春新堿(vincristine，VCR)誘導的大鼠腸梗阻模型和伊立替康(irinotecan hydrochloride infusion，CPT-11)誘導的大鼠腹瀉模型，通過代謝組學分析發現，模型大鼠結腸中犬尿氨酸(kynurenine，KYN)和喹啉酸(kynurenic acid，KA)水平急劇升高，進一步使用VCR、CPT-11干預人結腸上皮細胞(NCM460)，發現KYN和KA可明顯促進IL-6和芳烴受體基因(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的表達；結合研究報道IL-6和AHR均對修復受損腸道具有積極作用[14-16]，當加入特異性抑制劑(CH223191)阻斷或者敲除AHR基因時，AHR的作用被顯著抑制。此外Western blotting和RT-PCR檢測發現，IL-6能顯著促進吲哚胺2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1，IDO1)蛋白和mRNA的表達，IDO1可促進犬尿氨酸(kynurenine，KYH)的生成，進一步驗證了KYN和KA通過IL-6/IDO1/AHR正反饋通路發揮作用。

圖2 基于代謝物所在代謝途徑的研究策略Fig.2 Research strategies based on the metabolic pathways of metabolites

3 功能代謝組學在生物醫藥領域的應用

3.1 用于疾病發病機制與致病靶點的研究 機體發生病理改變是由于體內發生了相應功能變化，進而其對應代謝物的含量水平發生改變，通過代謝組學發現差異代謝物后，對這些差異代謝物進行功能分析，即通過功能代謝組學可發現新的有利于疾病診斷的生物標志物，進一步深入揭示發病機制及潛在靶標。目前已有多位學者開展了功能代謝組學研究，并取得了一些積極的結果。

3.1.1 生物表型研究 生物表型研究常被用于揭示疾病特別是遺傳性疾病的生物標志物，如基因表型研究主要是利用影響染色質結構的小分子進行生化修飾，從而導致基因表達消失(如甲基化)或激活(如乙酰化)，從而揭示人類疾病的異質性和治療反應差異。而功能代謝組學可利用代謝組學手段有效讀取基因組和環境的影響，即提取疾病變化中具有相同生物表型的代謝產物，在此基礎上驗證影響同表型代謝物的相同基因、蛋白或酶，以此揭示疾病表型下的深刻內在變化[17]。Müllede等[18]通過代謝組學分析發現，敲除雷帕霉素靶蛋白復合體1(target of rapamycin complex 1，TORC1)的上游激活因子與雷帕霉素處理后的釀酒酵母菌的氨基酸代謝特征相似，主要表現為丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、支鏈氨基酸和芳香族化合物的含量增加，以及甘氨酸、絲氨酸和賴氨酸的含量減少，通過捕獲染色質轉錄調控區尋找與上述氨基酸變化表征相同的基因(如Dmch5、Dopt2和Dtef4等)，進一步采用雷帕霉素處理釀酒酵母菌，敲除這些基因后發現雷帕霉素的敏感性增加，再與文獻[19、20]證實的TORC1在氨基酸代謝中通過維持膜的轉運來調節膜泡介導的運輸功能進行關聯分析，得到雷帕霉素具有抑制TORC1表達作用的結論。

3.1.2 代謝途徑作為潛在的疾病治療靶標 代謝組學發現差異代謝物后，可通過生物信息學分析獲得差異代謝通路和途徑，但這些途徑是否在疾病中發揮作用尚不可知，功能代謝組學可進一步對差異代謝物所在代謝途徑關聯的關鍵酶或通路進行深入分析，主要通過開展實驗對代謝物所在的代謝途徑進行干預，也可與選擇性抑制劑結合使用加以佐證。例如，Yan等[21]發現，糖酵解是川楝素(toosendanin，TSN)致肝毒性的關鍵代謝途徑，而磷酸丙糖異構酶(triose-phosphate isomerase，TPIS)是該代謝途徑的主要酶，進一步采用TSN建立大鼠及原代肝細胞毒性模型，體內外研究均發現TSN抑制了糖酵解過程，且TPIS的活性被顯著抑制，表明TPIS及其所在的糖酵解途徑可能是TSN致肝毒性的關鍵靶標。

能量代謝改變是腫瘤的重要特征之一[22]，而癌基因和抑癌因子均可通過調節能量代謝發揮作用，因此，能量代謝途徑可能是腫瘤發病的重要機制。通過功能代謝組學可深入研究能量代謝途徑，揭示其在不同腫瘤中發揮的作用。例如，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是浸潤性乳腺腫瘤的主要類型之一，但目前預后工具和靶向治療方法的價值有限。Apaya等[23]發現，TNBC腫瘤組織中花生四烯酸細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)環氧酶和環氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EET)含量較正常乳腺組織明顯升高；qPCR檢測發現，CYP環氧酶過表達時TNBC腫瘤分子轉移能力減弱；進一步相關分析發現，TNBC腫瘤EET含量與CYP環氧酶基因的表達呈正相關，表明CYP環氧酶代謝途徑可作為TNBC腫瘤治療及預后的代謝靶標。

3.1.3 疾病靶點研究 功能代謝組學通過對代謝物關聯的酶、基因等的系統研究[24]，將生物體內的代謝通路上下游闡述清楚，而通路中的酶和基因可能是疾病的致病靶點，從而可多層次揭示疾病的發病機制，為疾病的早期診斷、預后評估和個性化治療提供科學依據。例如，Zhang等[25]發現冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)患者血漿中有36種差異代謝產物，其中一種差異顯著的代謝物N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)在CAD患者血漿中表達上調；體外研究發現，Neu5Ac可誘導心肌細胞活性降低，促使心肌細胞凋亡；進一步采用Western blotting檢測發現，Neu5Ac可誘導RhoA和Cdc42蛋白表達增加，激活ROCK1和ROCK2蛋白，促進c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)和細胞外信號調節激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)的磷酸化。此外，有研究發現，CAD患者和大鼠心肌缺血模型心臟中調節Neu5Ac生成的神經氨酸酶1的表達急劇增加，進一步印證了Neu5Ac及其關聯酶神經氨酸酶1可能是CAD發病的重要靶點。Nemet等[26]發現，腦血管疾病(cerebral vascular diseases，CVD)組(162例受試者)中一種腸道微生物代謝物——苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)顯著表達，進一步采用體外細胞實驗驗證PAGln的功能，發現其可誘導血小板聚集，誘導人骨髓來源的巨核母細胞以及人骨髓來源的紅細胞發生特定的凝血酶-凝血酶受體結合反應，加入G蛋白偶聯受體(G-proteincoupled receptor，GPCR)抑制劑后這種誘導作用減弱，繼續采用RNA敲除技術敲除血小板受體(A2A等)或加入受體抑制劑后可顯著阻斷PAGln誘導的血小板聚集反應，進一步證實了PAGln可通過GPCR介導血小板功能反應，具有引起血栓的風險，表明其可能是治療CVD的重要靶點。Peng等[27]采用基于毛細血管電泳質譜的代謝組學分析發現，人膠質瘤組織中亞牛磺酸水平明顯升高；進一步研究表明，亞牛磺酸可刺激人神經膠質細胞瘤細胞(U251)增殖，并證實其是通過競爭性抑制脯氨酸羥化酶結構域-2(PHD2)來激活缺氧信號通路，從而增強膠質瘤細胞的增殖和侵襲。此外，胱氨酸/牛磺酸代謝途徑被證實是細胞亞牛磺酸的主要來源途徑之一[28-29]。將膠質母細胞瘤異種移植到小鼠建立模型，給予亞牛磺酸的氧化代謝物牛磺酸喂養，結果顯示，牛磺酸可降低膠質瘤細胞中亞牛磺酸的含量，導致細胞生長阻滯[27]。綜上，亞牛磺酸水平升高可促進膠質瘤的生長，因此亞牛磺酸代謝途徑可能作為膠質母細胞瘤診斷和治療的全新途徑。

3.2 用于藥物作用機制的研究 通過監測藥物對機體內源性環境的擾動作用，找到藥物靶點及其代謝途徑和相應功能變化的信號通路，有助于用藥效果的最大化和用藥不良反應的最小化。功能代謝組學可從代謝組學對藥物作用后內源性小分子的監測拓展到對生物大分子的研究，從而為闡明藥物在機體內的作用機制提供新的途徑。目前水產養殖業中濫用抗生素常引起細菌耐藥，導致抗生素功效降低[30]，但其機制并不清楚。Zhao等[31]比較了硫酸新霉素敏感株與耐藥株之間的代謝差異，發現L-天冬氨酸在敏感株中的含量較高；進一步研究發現L-天冬氨酸可提高硫酸新霉素在金魚中的殺菌效果。此外，L-天冬氨酸與硫酸新霉素聯合使用可提高嗜水鏈球菌感染后金魚的成活率，表明L-天冬氨酸作為硫酸新霉素的增效劑，不僅可改善殺菌作用和抗菌藥物的功效，還可減少藥物的使用量及其殘留物的不良影響。Ma等[32]發現，已感染鏈球菌但未死亡的羅非魚中L-亮氨酸的含量較高，推測L-亮氨酸可提高羅非魚的生存能力，進一步采用口服和注射的方式給予被海豚鏈球菌感染的羅非魚外源性L-亮氨酸并檢測其抗菌能力，發現L-亮氨酸提高了羅非魚的生存率，且羅非魚以劑量依賴性的方式逃逸細菌感染。

此外，功能代謝組學也可用于探討藥物毒性的機制，這為藥物毒性研究提供了新的思路。Chan等[33]發現，對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)可提高動物或人體血清和尿液中脂肪酸及酰基肉堿的含量，并可通過抑制肉堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)的活性而導致肝毒性的發生；進一步通過HepG2肝細胞和小鼠動物實驗，加入CPT1抑制劑[N-乙酸-對苯醌亞胺(NAPQI)和依托莫司]，同時用過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptors α，PPARα)誘導劑非諾貝特預處理，發現非諾貝特可通過上調脂肪酸β-氧化基因的表達而減弱APAP對CPT1的抑制作用，這與PPARα可保護小鼠免于APAP毒性的報道相符[34-35]。

4 功能代謝組學的其他研究

4.1 網絡藥理學與功能代謝組學的結合 網絡藥理學主要利用人體代謝酶及蛋白質的相互作用網絡，分析藥物對疾病作用的特定節點，從基因、蛋白等分子水平分析藥物對疾病的干預作用及機制。功能代謝組學是從藥物作用后的代謝物自下入手，從而發現代謝物關聯的酶、基因和蛋白，也是從分子水平分析藥物對疾病的干預作用及機制。二者研究策略不同，結果必然存在差異，因此網絡藥理學和功能代謝組學結合可互為補充，更全面地揭示藥物作用的生物學意義及機制(圖3)。Sun等[36]發現，芒硝可通過上調鵝去氧膽酸含量來調節膽汁酸分泌，從而治療結直腸癌；同時采用網絡藥理學分析發現，鵝去氧膽酸可間接抑制與膽汁酸代謝相關且參與炎癥反應的相關蛋白激酶(如ERK1/2，NF-κB，Mapk和Akt)的活性，這幾種酶為FXR/RXR途徑的上游酶；進一步分析發現，芒硝可上調FXR受體的表達且通過激活FXR受體來調節炎癥通路，這與代謝組學和獨創性通路分析軟件(ingenuity pathway analysis，IPA)分析結果一致，對于更好地發現背后的生物學現象具有重要作用。

圖3 網絡藥理學與功能代謝組學聯用Fig.3 Combination of network pharmacology and functional metabolomics

4.2 功能代謝組學的延伸——重編程代謝組學代謝組學逐步發展至今天，一方面可分析代謝物的豐度，以及各種病理生理條件下的代謝途徑及代謝網絡，逐步實現基因-表型、基因-環境的聯系；另一方面，市售代謝物標準品干預研究對象后的效應與不同物種之間的基礎代謝物或相關蛋白、酶產生的效應相似，使得通過外源性代謝物重新編程代謝成為可能。在功能代謝組學闡明細胞應答機制的基礎上，對有功能的代謝途徑或者通路通過代謝調節劑(如干擾素IFN-α2b)進行重編程，可使關鍵標志物及相關代謝途徑對逆轉疾病發展、減緩藥物毒性或降低藥物耐藥性等產生積極影響，目前已應用于控制和預防病原體感染以及增強宿主抵抗病原體等方面[37]，進一步形成了通過功能代謝組學分析和重編程實驗來進行新陳代謝重建的全新策略[38]。但重編程代謝組學在生物醫藥研究中的應用尚處于起步階段。

5 總結與展望

綜上所述，功能代謝組學彌補了代謝組學單純研究病理生理變化與代謝物及代謝通路關系的不足，通過結合分子生物學技術實現了代謝-生化機制、代謝物-關聯基因、代謝物-關聯的蛋白/酶的整合分析[25]，實現了對生物系統中復雜相互作用的探索，并將細胞、生物體和種群進行多角度、深入的機制還原，系統研究特定生物學環境中代謝改變的功能，闡明導致代謝失調的主要生物學機制，在生物醫藥領域具有廣闊的應用前景。

但功能代謝組學尚存在以下問題：首先，功能代謝組學研究高度依賴代謝組學數據，因此繼續開發精準的代謝組學分析方法仍面臨挑戰[39]。其次，在功能驗證時，如何在大量的差異代謝物中篩選出具有較大意義的代謝物，目前的手段還是通過含量的差異倍數(fold-change)來判斷，但代謝物含量變化不一定與病理生理狀態緊密關聯。因此，迫切需要建立功能代謝物選擇原則，減少假陽性。最后，差異代謝物的功能驗證后如何轉化為靶點仍需更多的分子生物學技術來補充。