電化學適配體傳感器檢測生物標志物研究進展

馮雪晴，居 漪，李 卿，金中淦

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

長期以來，生物傳感器一直被期望成為醫學診斷和醫療領域的重要檢測和治療技術[1-2]。然而，在人體樣本的復雜生物環境下，生物傳感器的檢測性能受到限制[3]。目前，除用于糖尿病監測的血糖儀外，生物傳感器的商業化和實際應用很少。為快速、準確檢測疾病的生物標志物，研究人員通過各種分子生物技術和納米技術來提高生物傳感器的性能[4-5]。近年來，適配體作為高親和性和高特異性的“化學抗體”，受到越來越多的關注。適配體生物傳感器的優勢是能夠很好地模擬含有生物標志物的天然生物界面[6]，可以利用電活性物質在界面處通過構象改變產生的信號變化產生可被捕捉的生物信號。本文對采用適配體納米技術構建電化學生物傳感器的方法，以及生物傳感器在疾病生物標志物檢測中的應用進行綜述。

1 生物傳感器

生物傳感器是用來檢測生物標志物并將其轉化為可檢測的信號的裝置，由靶受體和信號轉換器2個部分組成。靶受體與生物標志物間的相互作用使信號形成，理想的靶受體應具有高度特異性和選擇性，可有效識別和特異性結合生物標志物，達到快速響應和輸出信號的目的。

適配體通過被固定在傳感器的界面上來捕獲溶液中的生物標志物。適配體識別生物標志物后，其電活性物質與電極的構象發生改變，電流響應隨電子轉移能力的改變發生相應變化，進而定量測定待測物濃度。與溶液中的識別不同，界面處的適配體識別受到待測生物標志物可及性的限制，這些限制對靈敏度、特異性和檢測速度造成了影響，需要減少界面的異質性，并克服能量障礙，以改善適配體在生物傳感界面處的熱力學和動力學反應[7]。以在金電極表面組裝巰基適配體為例，適配體的巰基可以與金電極形成Au-S鍵，并相互作用，使其從溶液中自發吸附到金電極上，然后重組為自組裝單層[8]，當Au-S鍵的自由能低于溶解適配體的溶劑時，即可以形成穩定的自組裝單層。

2 適配體納米技術

適配體是一段寡核苷酸序列，利用指數富集進化技術從寡核苷酸的配體庫中被篩選出來。與診斷試劑常用的抗體相比，適配體可以識別生物標志物細微的結構差異，且解離常數高，可識別皮摩爾～納摩爾級生物標志物靶標[9-11]。功能性適配體可與有機、無機、生物分子結合并發生反應，如蛋白質，氨基酸、金屬離子、病毒、細菌、藥物、甚至細胞[12-14]，在疾病診斷和治療、臨床檢驗和藥物開發等方面有著巨大的發展潛力。1980年，JONES等[15]首次提出具有特定序列和結構的寡核苷酸可以用于電極表面的自組裝，利用熱力學定律可以精確得出適配體的折疊狀態和適配體之間的相互作用。由于可以控制適配體的形狀和長短，且可被靈活修飾，這種高度靈活的組裝能夠形成具有特定理化性質和功能的結構。這些優勢可以應用在生物傳感器的構建上。

3 生物傳感器組裝方式

3.1 小分子輔助界面

適配體可以通過非特異性吸附于金電極表面來有效識別標志物。小分子輔助界面可以使適配體垂直定向在界面上，并通過6-巰基己醇、二硫蘇糖醇和3-巰基丙酸等分子取代適配體堿基的非特異性吸附，提高其特異性識別能力。由巰基適配體和6-巰基己醇組成的間隔雙組分單分子層可以最大限度地減少適配體和金電極的非特異性吸附，提高適配體在金電極界面的識別效率。目前，小分子輔助界面已被廣泛應用于提高適配體傳感器的識別效率、降低檢測限、增強靈敏度。ZHANG等[16]使用適配體/6-巰基己醇混合自組裝單層，將表面識別效率提高到了85%，通過將適配體的表面分子密度從1.2×1013個/cm2降低到1.2×1012個/cm2，提高了檢測靈敏度，證實了使用6-巰基己醇和巰基適配體形成二元自組裝單層有利于提高生物傳感器的性能。

3.2 多腺嘌呤介導的界面

適配體堿基和金電極相互作用的相關研究結果表明，適配體堿基對金電極的親和力遵循A>C≥G>T的順序[17]。腺嘌呤在金電極表面上吸附力很強，結合力可與眾所周知的Au-S鍵相媲美，金元素的存在甚至可以使腺嘌呤和胸腺嘧啶的雙鏈體變性。腺嘌呤與金電極的強結合親和力在設計不含巰基的適配體中具有很好的應用前景[18]。為了控制適配體的構象和接枝密度，可用腺嘌呤作為錨定基團和密度控制基團，使電極上的適配體密度隨著腺嘌呤長度的增加而降低；此外，腺嘌呤可優先與金電極結合，阻止其他材料吸附于金電極，這一特性非常有效地阻止了其他材料的非特異性吸附。

3.3 納米材料組裝界面

納米材料[19-20]組裝界面一般通過改變界面處的傳質來提高生物傳感器的便捷性。BESANT等[21]開發了納米材料微電極，用于研究生物傳感器的靈敏度；他們通過在硅片上制備電沉積后組裝巰基適配體來制備納米材料微電極，并進行分子動力學模擬，證實了納米材料微電極可以抑制適配體聚集，并增加界面傳質，從而提高適配體的識別性能；該研究結果顯示，納米材料微電極適配體傳感器的靈敏度與普通電極相比，提高了10 000倍；并發現納米材料微電極傳感器的超高靈敏度具有很多優勢，如可以在30 min內檢測到細菌的RNA。基于納米材料微電極的適配體檢測平臺可用于檢測一系列生物標志物，包括病原抗菌藥物耐藥性標志物和腫瘤生物標志物。

3.4 基于框架核酸的組裝界面

框架核酸的中空結構使空間能夠被最大化利用，非常適合在界面處組裝[22]，可以提供具有低成本和高重現性的高分辨率的界面。適配體連接的框架核酸錨定到界面上，可用于生物傳感的開發。PEI等[23]在框架核酸的頂部連上1個適配體，結果顯示，凝血酶與適配體形成了穩定的夾層結構，這一方法可用來特異性檢測凝血酶。類似的方法也可以應用于其他標志物的檢測。

4 適配體傳感器在生物標志物檢測中的應用

4.1 用于腫瘤生物標志物檢測

目前，適配體生物傳感器已被用于各種腫瘤生物標志物、抗原和細胞的檢測，如人類表皮生長因子受體2、血管內皮生長因子、表皮生長因子受體、PDGF黏液蛋白1、前列腺特異性抗原和癌胚抗原。

4.1.1 抗原類生物標志物檢測 過去幾十年，基于適配體的生物傳感器因其良好的靈敏度和選擇性、快速響應和低成本等優點，被廣泛應用于低濃度抗原類標志物的檢測。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是在胚胎內胚層上皮中發現的潛在生物標志物，一般用于監測結直腸癌的治療效果，以及輔助診斷乳腺癌、胃腸道腫瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。MAZLOUM-ARDAKANI等[24]開發了一種基于多壁碳納米管、血紅素和石墨烯納米片的電化學適配體傳感器，用于檢測CEA，線性范圍為1.0×10-15～1.0×10-8g/mL，檢測限為0.82 fg/mL；檢測原理為納米復合材料多壁碳納米管可提高導電性，并加速血紅素和電極之間的電子轉移，當CEA結合適配體時，血紅素的信號會進一步降低。這種低成本、高靈敏度和特異性的生物傳感器在臨床樣本CEA檢測中有較大的應用價值。見圖1。

圖1 用于檢測CEA的適配體傳感器的制備和工作示意圖[24]

4.1.2 循環腫瘤細胞檢測 循環腫瘤細胞由原發腫瘤組織脫落后，可進入血液循環和淋巴循環，因其在腫瘤轉移早期階段出現，已成為癌癥監測和診斷的重要生物標志物[25]。YANG等[26]開發了一種DNA標記夾心電化學生物傳感器，基于3D石墨烯和金納米籠/氨基化多壁碳納米管混合物，采用差分脈沖伏安法檢測乳腺癌細胞MCF-7；由于納米材料具有放大信號的優勢，這種電化學傳感器檢測MCF-7細胞時表現出高特異性和高靈敏度的優勢，檢測范圍為1.0×102～1.0×106個/mL，檢測限低至80 個/mL。這種方法具有很大的實際應用潛力，在癌癥診斷中具有較好的前景。

4.1.3 外泌體檢測 外泌體是一種細胞外囊泡，直徑為30～150 nm，可以調節腫瘤微環境，被認為是最重要的腫瘤生物標志物之一[27]。

ZHOU等[28]將適配體固定在電極的表面，在互補適配體的一端修飾電活性物質亞甲藍，當目標外泌體存在時，CD63適配體可以識別外泌體上的CD63蛋白膜，電活性物質在電極上的電信號發生改變，從而實現外泌體的檢測。見圖2。

圖2 基于適配體檢測外泌體的示意圖[28]

4.2 用于心血管疾病生物標志物檢測

心血管疾病是人類健康的最大威脅，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點。開發操作簡單、靈敏、低成本的心血管疾病生物標志物傳感器非常必要。QIAO等[29]開發了基于適配體-MoS2納米共軛物的電化學傳感器，用于檢測心肌肌鈣蛋白I，并與基于Au@SiO2@Au納米顆粒的電化學傳感器的檢測效能進行比較，結果顯示，2種傳感器均可以檢測人血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I，但基于適配體-MoS2納米共軛物的電化學傳感器檢測心肌肌鈣蛋白I的線性范圍為10 pmol/L～1.0 μmol/L，檢測限為0.95 pmol/L，較適配體Au@SiO2@Au傳感器具有更低的檢測限；此外，在不含有肌酸激酶MB同工酶和肌紅蛋白的樣本中，2種傳感器均表現出良好的診斷效能。

4.3 用于阿爾茨海默病生物標志物檢測

阿爾茨海默病的神經紊亂是進行性且不可逆的，會導致患者記憶喪失，且患者后期一般生活無法自理。β-淀粉樣蛋白是臨床早期診斷阿爾茨海默病的生物標志物。目前，已經有適配體生物傳感器用于Aβ蛋白檢測，基于這種電化學生物傳感器開發的檢測設備，具有靈敏度高、操作簡單、性能穩定、成本低、可小型化的優點，有較好的臨床應用前景。

ZHANG等[30]發現，具有電活性的莖環適配體被固定在金電極上后，適配體上修飾的電活性物質二茂鐵（Fc）可通過識別淀粉樣蛋白寡聚體前后的構象變化導致的電荷轉移量的變化來檢測淀粉樣蛋白寡聚體，莖環（B-3'Fc）適配體與淀粉樣蛋白寡聚體結合后，Fc峰電流會降低；此外，通過優化交流伏安法的檢測頻率，可以進一步降低傳感器的檢測限，但同時會使檢測范圍變窄；基于這一發現，他們開發了一種基于莖環的電化學適配體傳感器，可高選擇性和高靈敏度地定量亞皮摩爾濃度的淀粉樣蛋白寡聚體，可能有利于阿爾茨海默病的診斷。

4.4 病原微生物標志物檢測

微生物中的致病菌可以導致人類疾病，給人類健康和公共衛生帶來諸多挑戰。傳統的微生物檢測方法需要在培養基中培養病原菌，然后進行鑒定。用這種方法得到的結果雖然準確，但是至少需要4～7 d才能得到結果。其他方法，如酶聯免疫吸附試驗，依賴于抗原-抗體反應，易受pH值和溫度等環境因素的影響。電化學適配體生物傳感器病原體檢測技術具有操作簡單、成本低、靈敏度高、信號穩定、可小型化等諸多優勢，且可與微制造工藝兼容，并進行真實樣品檢測[29]。

DAI等[31]發現，具有反式切割活性的Cas12a核酸內切酶可對單鏈DNA啟動反式切割，將標記有亞甲基藍的單鏈DNA固定在金電極電化學傳感器，在待測物存在的條件下，Cas12acrRNA可啟動對非特異性單鏈DNA 的反式切割，使亞甲藍的電流降低；基于這一發現，他們開發了一種基于CRISPR Cas12a（cpf1）的電化學生物傳感器——E-CRISPR，為了證明其系統通用性，他們將開發的E-CRIPSR首次應用于人乳頭瘤病毒和細小病毒B1916核酸檢測，結果顯示，由于優化了Cas12a體外反式切割的化學環境，無需任何酶促進擴增，E-CRISPR達到了皮摩爾水平的檢測限；他們進一步設計了基于E-CRISPR級聯的蛋白質靶點，用于檢測臨床樣本中的轉化生長因子-β1蛋白。相信在電化學和CRISPR的結合下，E-CRISPR可以成為便攜、精準和低成本的即時診斷系統的強大推動力。E-CRISPR的檢測原理見圖3。

圖3 E-CRISPR的檢測原理[31]

5 總結和展望

適配體傳感器在生物標志物的定量和定性檢測上有很多的應用。寡核苷酸適配體被認為是可識別生物標志物的智能分子。但是，盡管適配體已經被用于多種傳感平臺，仍有很多需要解決的問題和挑戰。

（1）大規模生產DNA/RNA適配體成本較高，且由于酶的存在，許多適配體在人血液中會被快速降解。有研究發現，添加具有生物相容性的官能團可提高其耐酶性；開發異種核酸作為有效和通用的適配體，在適配體的實際應用中也有較好的前景[32]。

（2）靈敏度需要進一步提高。將適配體與量子點、金屬納米粒子等納米材料結合[33-34]，采用DNA納米機器和滾動圓放大、聚合酶鏈反應等技術，可以提高適配體傳感器的靈敏度。ZHANG等[35]提出了一種組裝方法——Bindinginduced DNA，可以檢測復雜樣本中低濃度的目標分子，這種檢測方法可以應用于脂類、核酸、低聚糖、病毒和病原體等多種生物分子的檢測。另外，信號放大也是在極低濃度被測物條件下提高檢測靈敏度的有效策略[36]。

（3）適配體臨床檢測應用受限。雖然目前關于適配體傳感器的研究較多[37-38]，但因信噪比較低、細胞基質和體液可能會掩蔽適配體、多通道檢測困難等不足，使適配體傳感器的臨床應用受到很大限制。傳感器的設計方面，可以將多個適配體固定在檢測平臺上，以同時檢測多種疾病標志物；另外，以納米技術為基礎的檢測平臺，有望實現高選擇性、高特異性、低成本、高效、快速、多通道檢測的目標。相信隨著研究的不斷深入，適配體傳感器會廣泛應用于臨床檢測。