CD200在慢性淋巴細胞白血病相關疾病診斷中的價值

洪 俊,饒永彩

1.武漢大學人民醫院檢驗科,湖北武漢 430060；2.武漢生物制品所，湖北武漢 430060

B細胞慢性淋巴細胞增生性疾病(B-CLPD)是由成熟B淋巴細胞引起的累及外周血、骨髓和繼發性淋巴器官如淋巴結和脾臟的一大類疾病。世界衛生組織(WHO)根據這類疾病的組織病理學特征、免疫表型和遺傳變異特征對其進行了分類[1-3]。慢性淋巴細胞性白血病(CLL)相關疾病是B-CLPD中最常見的一類，其特點為成熟形態的淋巴細胞在體內積聚，使血液和骨髓中淋巴細胞增多，進而引起淋巴結、肝、脾大，并可累及其他組織器官，CLL相關疾病主要包括CLL、單克隆B細胞淋巴細胞增多癥(MBL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)，現在一般認為CLL與SLL本質上是同一種疾病,因主要累及部位不同而造成了不同表現形式[3-4]。研究表明，免疫表型在CLL相關疾病的診斷中具有重要的參考價值，一般認為如果患者每微升血液出現超過5 000個具有獨特免疫表型(即SmIg弱表達，CD5+CD19+、CD20弱表達和CD23+)的單克隆B細胞，即可診斷CLL相關疾病[4-7]。MATUTES等[7]根據細胞免疫表型抗原譜設計了Matutes免疫表型評分(MS)系統用于CLL相關疾病的診斷。在該評分系統中，根據5個標記的表達情況進行計分(CD5、CD23、FMC7、SmIg和CD79b陽性各記1分)；大多數CLL相關疾病病例的得分為4或5分，而非CLL相關疾病病例的得分小于4分。目前，國際CLL工作組(IWCLL)、WHO和歐洲CLL研究倡議(ERIC)已更新了當前的CLL診斷標準[8-11]。大量研究表明，CD200可能是診斷B-CLPD特別是CLL相關疾病極為有用的標志物[12-15]。本研究的目的是驗證CD200在CLL診斷中是否有用，并分析了添加CD200是否可以提高MS在CLL相關疾病診斷中的診斷效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年11月至2019年6月在武漢大學人民醫院就診及住院治療的200例疑似B-CLPD患者的骨髓標本。納入標準：淋巴細胞數量增多(>5×109/L)和/或發現輕鏈限制表達單克隆B細胞群；根據IWCLL和WHO指南確診[2]。排除標準：合并其他腫瘤以及可能影響CD200表達水平的漿細胞疾病患者。在B-CLPD患者中，CLL相關疾病患者(CLL相關組)136例，占68%(136/200)，包括CLL 108例、MBL 20例和SLL 8例；非CLL相關疾病患者(非CLL相關組)64例，占32%(64/200),包括邊緣區淋巴瘤(MZL)32例、套細胞淋巴瘤(MCL)8例、濾泡性淋巴瘤(FL)2例，其他B-CLPD 22例。納入研究的患者均對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2儀器與試劑 主要檢測儀器為BD Canto Ⅱ流式細胞儀，美國BD公司生產。所用檢測試劑為BD公司原廠配套試劑。

1.3方法

1.3.1流式細胞術 流式檢測樣本處理方法參考文獻[16]。流式細胞儀檢測以下熒光標記單克隆抗體組合：CD8、CD19/CD3、CD56/CD4、κ/λ/CD/19、FMC7/CD5/CD19、CD79b/CD23/CD19、CD38/CD200/CD19、CD79b/CD20/CD10。用4色組合的單克隆抗體進行全骨髓染色(1×106個/100 μL)。在黑暗中孵育30 min后，細胞在5 min內用BD FACS裂解液裂解，并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌。隨后，將細胞重懸于500 μL PBS中，并用美國BD Canto Ⅱ流式細胞儀對所有樣本進行檢測，數據分析采用FACS-Diva軟件；檢測前，用CST校準微球校準流式細胞儀的電壓及增益。每個樣品測定管至少取細胞數200 000個。

通過CD45和散射光側向角(SSC)的特點將細胞分為淋巴細胞群、單核細胞群、粒細胞群、原始細胞群、前體細胞群及有核紅細胞群。使用BD Paint-A-Gate軟件(Becton Dickinson)對根據前向和側向散射特征(FSC/SSC)控制的淋巴細胞群體進行了分析。選擇CD19+細胞，并收集每種標志物陽性細胞的百分比。另外，CD200表達采用陽性細胞百分比和平均熒光強度比(MFIR)兩種方式表示。根據B細胞群上熒光軸的對數刻度，評估CD200表達模式(弱、中或高)：當陽性峰值在第1個對數百分位數之內時為弱表達，在>第1個對數百分位數至<第2個百分位數時為中等表達，而在第2個百分位數及以上的則為高表達[5]。

1.3.2MS MS的判定方法參考文獻[7]。具體如下：當FMC7和CD79b陽性細胞群<30%時，被認為在CLL相關疾病的診斷中得1分；當CD5和CD23陽性細胞群為≥30%時，得分為1分；當SmIg表達較弱時，得分為1分。典型的CLL相關疾病的病例被定義為≥4分，非典型病例定義為<4分。在確診非典型CLL相關疾病之前，應參考臨床和/或細胞遺傳學/分子生物學檢查結果以排除白血病期的淋巴瘤。

為了研究CD200在CLL相關疾病中的診斷價值，根據以往研究，將CD200陽性細胞比例30%作為陽性判斷的臨界值：≥30%為陽性，<30%為陰性[17-18]。當CD200陽性細胞群≥30%時，被視為得1分。同時對采用MFIR判別CD200陽性的臨界值進行評估。根據以往的研究[15]，陽性閾值設置為18分，MFIR≥18分為陽性，MFIR<18分為陰性。

1.4統計學處理 使用SPSS22.0統計軟件進行數據分析。對靈敏度、特異度和準確性進行分析。當CD200添加到MS時，總積分≥4分，考慮CLL相關疾病的診斷。以原MS為對照，采用McNemar檢驗評估采用CD200改進評分系統后與原MS系統間的差異。非正態分布的計量資料用M(P25,P75)表示，使用Whitney′sU檢驗進行組間比較。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CD200在B-CLPD中的表達 CD200在B-CLPD中的表達情況見表1。當CD200的表達情況以陽性細胞百分比表示時，CLL相關組的CD200表達水平高于非CLL相關組[99.4%(95.0%，100.0%)vs.70.1%(0.4%,99.9%),U=38,P<0.05],見圖1A。所有CLL相關組患者的CD200陽性細胞百分比均高于30%；而在非CLL相關組中，CD200陽性細胞百分比呈高度異質性，例如MCL的百分比非常低，而其他B-CLPD的百分比較高。此外，1例MCL(1/8，12.5%),18例MZL(18/32，56.2%)和2例FL(2/2,100.0%)的CD200陽性細胞百分比超過30%。

表1 CD200在B-CLPD中的表達情況

當CD200表達強度以MFIR表示時，CLL相關組CD200表達水平同樣高于非CLL組[51.4(4.2，121.0)vs.13.0(1.0,62.1),U=44,P<0.05]，見圖1A。CLL相關組136例患者中有121例(88.9%)表現出CD200高表達，非CLL相關組64例患者中有24例(37.5%)表現出CD200高表達。CD200細胞的MFIR通常在CLL病例中較高，在FL和MZL中為中等，而在MCL中則較低。在CLL組中，80例典型CLL(MS 4～5分)和28例非典型CLL病例(MS 0～3分)間比較，無論是以CD200陽性細胞百分比還是MFIR表示，CD200均為高表達，差異均無統計學意義(P>0.05),見圖1B。

注：A為CLL相關組和非CLL相關組CD200表達水平的比較；B為MS 4～5分和MS 0～3分的CLL患者間CD200表達水平的比較；無填充顏色為以陽性細胞百分比表示的CD200表達水平，淺灰色表示以MFIR表示的CD200表達水平。

2.2CD200作為單個標志物用于CLL診斷的價值 為了研究CD200在區分CLL相關疾病和其他B-CLPD中的價值，對CD200的靈敏度、特異度和準確性進行了分析并與MS中的標志物進行了比較，見表2。CD200表達水平以陽性細胞百分比表示時，其靈敏度明顯高于FMC7、CD79b和SmIg(χ2=6.51、6.12、6.78,P<0.05)，與CD23和CD5相比差異均無統計學意義(χ2=0.21、0.32，P>0.05)；其特異度為44.1%，明顯低于其他標志物(FMC7、CD79b、CD23、CD5、SmIg，χ2=7.41、6.21、6.98、7.18、6.98,P<0.05)；而其準確性明顯高于SmIg(P<0.05)，而與其他MS標志物相似(P>0.05)。對CD200表達水平的兩種表示方式(陽性細胞百分比和MFIR)進行評估，結果表明二者在準確性方面相似(分別為81.1%和80.1%)而靈敏度方面MFIR較低(100.0%vs.77.9%,χ2=6.20,P<0.05)，特異度方面MFIR更高(44.1%vs. 85.1%,χ2=8.20,P<0.05)。

表2 單個標志物在CLL相關疾病與非CLL相關疾病鑒別診斷中的靈敏度、特異度和準確性

2.3將CD200加入MS中的實用價值 在本研究中，136例CLL病例中有108例表現出典型表型(MS≥4分)，28例表現出非典型表型(MS<4分)，見表3。所有非CLL相關患者均顯示MS低于4分。在MS中添加CD200(以陽性細胞百分比表示表達水平)改變了19例患者的診斷：在CLL相關組，原MS診斷為非典型CLL相關疾病的28例患者中有16例從3分變為≥4分；在非CLL相關組，當添加CD200后，64例中有3例的MS變為4分。CD200的添加將MS的準確性從84.3%提高到94.7%(McNemar檢驗，P<0.01)。值得注意的是，MS中CD200替代SmIg后，準確性從84.3%提高到94.5%(McNemar檢驗，P<0.01)，見表4。使用MFIR表示CD200的表達水平也顯示了相似的準確性(數據未展示)。

表3 按MS和改進替代評分對患者進行分類(n)

表4 幾種評分系統在CLL相關與非CLL相關疾病鑒別診斷中的靈敏度、特異度和準確性[M(P25,P75)，%]

3 討 論

流式細胞儀免疫表型分析是診斷B淋巴細胞增生性疾病(包括CLL)不可或缺的技術[2,3,11]。有學者基于白血病細胞膜表面分化抗原CD5、CD23、FMC7、SmIg和CD22/CD79b的表達情況，建立了用于CLL診斷的MS系統，時至今日仍被認為是一種非常有效用的CLL診斷工具，并被眾多臨床實驗室廣泛使用[7-8]。國外研究發現了多種CLL腫瘤細胞表達的新免疫標志物[18-19]。其中，作為Ig受體膜蛋白超家族成員的CD200被認為對CLL診斷有較好的特異性[12-15]。本研究旨在探討CD200在CLL診斷中的作用，以及該標志物是否能增加MS的診斷效能。

目前，多個研究從方法學角度證實了無論是以陽性細胞百分比還是以MFIR表示CD200的表達水平，其在幾種淋巴增生性疾病中的表達水平都有差異[14,17]。此外，有部分學者認為使用MFIR來表示CD200表達水平有助于確保不同實驗室之間檢測的可重復性。本研究發現CD200的MFIR和陽性細胞百分比兩種表達方式在區分不同類別的B-CPLD方面具有相同的準確性。此外，雖然MFIR在確保不同實驗室之間的技術可重復性方面有部分優勢，但由于MFIR存在換算環節，因此在常規臨床實踐中并不十分方便。

本研究中，所有CLL相關疾病病例(包括具有非典型表型的病例)CD200均為陽性表達，而且CLL相關疾病中的CD200表達水平明顯高于其他B-CLPD；這與國外研究結論基本一致，這表明CD200具有作為CLL相關疾病表型標志物的潛在價值[12-13,17]。國外研究主要集中在CD200區分CLL和MCL的作用，而在這些研究中CD200在CLL中全部陽性，而在MCL中幾乎不表達[20]。本研究中，發現有少數MCL病例的CD200可以呈現出與CLL相比較低水平的表達。此外，本研究還觀察到在其他B-CLPD(非MCL)中CD200存在差異性表達。綜上所述，筆者認為CD200強表達在CLL中很常見，但CD200可以在包括MZL和FL在內的B細胞腫瘤中呈現不同程度的差異性表達[21]。因此,僅靠CD200一個標志物是不能夠完全區分不同B-CLPD的，但是如果將CD200加入MS系統中也許有改善MS對CLL相關疾病診斷準確性的可能；當前相關研究極少[13]。本研究對這個問題進行了探討，結果表明加入CD200能有效提高MS在CLL診斷中的準確性。此外，本研究還表明，在MS中直接加入CD200或用CD200代替SmIg作為診斷標志物都能起到類似的作用，且二者效果無差別。這是可能與SmIg的表達水平難以評估，而且在B-CLPD中的表達存在高度差異性有關[18]。

總之，CD200是CLL相關疾病診斷中有價值的標志物，盡管特異性不強，但結合MS使用可明顯提高CLL相關疾病診斷的準確性。此外,CD200在疑似CLL相關疾病病例中可能是有用的診斷標記，特別是在CLL相關疾病與MCL的鑒別診斷中。