基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探究葛根芩連湯“異病同治”結直腸癌和2型糖尿病作用機制

張欣怡，林翔，劉希樵，張爍，黃宣

1.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率在全球消化道惡性腫瘤中居第3位。根據(jù)其癥狀，與中醫(yī)“便秘”“泄瀉”“便血”等相關，主要由于先天不足、飲食失節(jié)或外邪入侵等因素導致正氣虧虛，脾胃失健，濕熱毒邪積聚腸道所致。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）屬中醫(yī)學“消渴”范疇，是由于先天虧虛或后天飲食失節(jié)等，導致肺、脾、腎三臟陰液虧虛，水谷精微納運失常，進而出現(xiàn)多食、喜飲、多尿等典型癥狀。“異病同治”是指采用同一方法治療具有相同病機的不同疾病。葛根芩連湯出自《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草組成，用于治療太陽風寒表虛誤用下法后，腸胃損傷，邪熱入里，熱迫大腸而下利之證，后世主要用于治療邪熱下迫大腸引起的腸鳴腹瀉等。臨床表明，葛根芩連湯對于CRC和T2DM均有較好的療效。Li 等發(fā)現(xiàn)，服用葛根芩連湯的CRC患者腹痛、腹瀉、里急后重等癥狀得到明顯改善。Lv等通過試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根芩連湯治療后的小鼠瘤體尺寸明顯小于對照組，表明葛根芩連湯有抑制CRC腫瘤細胞生長的作用。Meta分析結果表明，葛根芩連湯對T2DM療效確切。Xu等研究顯示，葛根芩連湯對糖尿病大鼠有明顯的降糖作用。目前對于葛根芩連湯治療CRC與T2DM共同機制的研究相對不足。本研究運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接方法探索葛根芩連湯治療CRC和T2DM的共同作用機制，為中醫(yī)“異病同治”的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及其靶點獲取

通過TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）及中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）檢索葛根芩連湯組方藥物葛根、黃連、黃芩、甘草的化學成分，根據(jù)TCMSP藥代動力學參數(shù)（ADME），以口服生物利用度（OB）≥20%和類藥性（DL）≥0.1作為標準篩選活性成分。通過TCMSP檢索活性成分相關靶點。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），獲得靶點對應標準基因名（gene symbol），物種篩選條件為“human”。

1.2 疾病靶點及交集靶點獲取

通過TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“colorectal cancer”“rectal cancer”“colon cancer”為關鍵詞檢索CRC 相關靶點，以“type 2 diabetes”“diabetes mellitus,type 2”為關鍵詞檢索T2DM相關靶點。刪除重復靶點后，使用Draw Venn Diagram 在線分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲得葛根芩連湯與CRC 和T2DM的交集靶點。

1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構建

將交集靶點與活性成分導入Cytoscape3.8.2軟件，利用Analyze Network 功能進行拓撲分析，計算度值（degree）及介數(shù)中心性（betweenness centrality），并以節(jié)點度值大小為主要依據(jù)構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建及核心靶點分析

將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/），設定物種為“Homo sapiens”，設定最低蛋白質互作可信度為0.7，隱藏網(wǎng)絡中孤立靶點，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡，保存為tsv文件。利用Cytoscape3.8.2軟件Analyze Network功能對靶基因進行拓撲分析，然后使用其CytoHubba插件，篩選度值排名前50位靶點，作為潛在作用靶點，進行后續(xù)分析。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html），選擇物種為“H.sapiens”，個性化分析（Custom Analyse），進行GO功能和KEGG通路富集分析。篩選條件為≤0.01，將分析結果按值從小到大排列，利用微生信在線作圖工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化分析。

1.6 分子對接

選取潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡中度值排名前5位靶點作為受體蛋白，取關聯(lián)靶點數(shù)排名前5位的活性成分作為配體小分子，進行分子對接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中找到靶蛋白的3D結構模式，保存為“PDB”格式文件。從TCMSP下載5種活性成分的結構模式，保存為“MOL2”格式。使用AutoDockTools1.5.6軟件對受體蛋白和配體小分子進行去水分子、添加非極性氫、計算蛋白質結構的電荷、搜索配體分子的可旋轉化學鍵等操作，并輸出為PDBQT格式文件。根據(jù)受體與配體的結構大小設定合適的對接盒子及對接參數(shù)，設定對接形式為半柔性對接，即受體蛋白設置為剛性，配體分子設置為柔性。根據(jù)受體-配體結合能選取部分對接結果，利用PyMOL軟件進行可視化分析。

2 結果

2.1 葛根芩連湯活性成分與靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索及篩選，共得到葛根芩連湯活性化學成分204種，包括葛根7種、黃連21種、黃芩51種、甘草125種，其中8種為共有成分。OB值前30位活性成分見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索對應靶蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索對應靶蛋白名稱，去重并校對后得到333個作用靶點。

表1 葛根芩連湯主要活性成分（OB值前30位）

2.2 疾病靶點及交集靶點

檢索GeneCards、TTD、DrugBank、OMIM 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選及合并去重后得到CRC相關靶點3 323個、T2DM相關靶點3 301個，將葛根芩連湯治療2種疾病的靶點取交集，得到210個交集靶點，即葛根芩連湯“異病同治”2種疾病的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

由葛根芩連湯活性成分及藥物與疾病交集靶點構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡，包括369個節(jié)點和2 091條邊，節(jié)點分別為210個交集靶點、4種藥物和155種活性成分。關聯(lián)靶點數(shù)前5位活性成分為槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、山柰酚（Kaempferol）、葛根素（Puerarin）、漢黃芩素（Wogonin）。此類成分為多目標和多效應化合物。槲皮素關聯(lián)靶點數(shù)最多，為123個。研究表明，槲皮素可改善糖脂代謝紊亂，能通過免疫激活和增加細胞黏附而促進癌細胞凋亡。PTGS2（前列腺素內過氧化物合酶2）關聯(lián)的活性成分數(shù)量最多，有137種。前10位活性成分見表2。藥物-成分-靶點網(wǎng)絡見圖2。

圖2 葛根芩連湯治療CRC和T2DM藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

表2 葛根芩連湯治療CRC和T2DM藥物-成分-靶點網(wǎng)絡度值前10位活性成分

2.4 交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡及核心靶點分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫，設置蛋白互作可信度≥0.7，獲得包含210個節(jié)點和2 120條邊的網(wǎng)絡，其中孤立靶點4個。將該網(wǎng)絡以TSV格式導入Cytoscape3.8.2進行拓撲分析。使用該軟件的Cytohubba插件，選取度值前50位靶點構建PPI網(wǎng)絡（見圖3），該網(wǎng)絡由50個節(jié)點、670條邊組成。AKT1（RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6（白細胞介素6）、TP53（腫瘤蛋白P53）、MAPK8（絲裂原激活蛋白激酶8）、VEGFA（血管內皮生長因子A）、TNF（腫瘤壞死因子）是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的潛在核心靶點。度值前30位靶點及其拓撲分析結果見表3。

表3 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點PPI網(wǎng)絡前30位靶點拓撲分析

圖3 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點PPI網(wǎng)絡

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析得到生物過程（BP）2 622條，細胞組分（CC）133條，分子功能（MF）206條。值前10位條目見圖4。交集靶點主要參與毒性物質反應、創(chuàng)傷應激、對無機物質的反應、凋亡信號通路等生物過程，主要分布于胞膜、囊泡空腔、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等細胞組分，與調控蛋白激酶、轉錄因子和細胞因子受體等物質的結合及活性、調節(jié)磷酸轉移酶活性等分子功能關聯(lián)性較大。

圖4 葛根芩連湯治療CRC和T2DM靶點GO功能富集分析

KEGG通路富集分析得到通路375條，值前20位通路見圖5。交集靶點主要作用于癌癥、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF和IL-17信號通路、內分泌抑制和Th17細胞分化等通路，與上述通路關聯(lián)最多的靶點為AKT1。

圖5 葛根芩連湯治療CRC和T2DM靶點KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結果

一般認為，分子對接結合能小于0 kcal/mol表明兩者之間對接良好，結合能數(shù)值越小表明兩者之間的結合越緊密。度值前5 位的核心靶蛋白分別為AKT1、TP53、IL6、MAPK8、TNF，關聯(lián)靶點數(shù)前5位的活性成分分別為槲皮素、芹菜素、山柰酚、葛根素和漢黃芩素。運用AutoDockTools軟件對核心靶點與主要活性成分進行分子對接，結果各靶點與活性成分的對接結合能均小于0 kcal/mol，表明受體蛋白與配體小分子之間均存在良好的結合活性，分子對接結果見表4。TP53蛋白較其他蛋白與活性成分之間有較高的結合活性，選取TP53與5種配體小分子之間的結合通過PyMOL進行可視化分析，結果見圖6。

表4 核心靶點與主要活性成分分子對接平均結合能（kcal/mol）

圖6 TP53與葛根芩連湯核心成分分子對接模式

3 討論

“異病同治”是重要的中醫(yī)治則，相關研究證實該理論用于臨床的正確性。CRC與T2DM在病機上都存在脾胃運化失調，水谷精微輸布失常的特點。葛根芩連湯方中葛根有生津止渴、健脾升陽止瀉之功，黃芩和黃連有清熱解毒燥濕之力，甘草有補中調脾胃之效，臨床用于T2DM和CRC療效確切。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM與CRC在發(fā)病、診斷、治療等方面關系密切，T2DM會影響CRC的早期篩查。長期服用降糖藥可以改善CRC術后患者的預后，延長其生存期。有數(shù)據(jù)顯示，二甲雙胍可提高CRC患者的生存率，同時改善T2DM合并CRC患者的免疫微環(huán)境和腸道微環(huán)境。相關數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯存在對CRC和T2DM的治療靶點。本研究基于中醫(yī)“異病同治”理論，以網(wǎng)絡藥理學為分析工具，從葛根芩連湯治療CRC和T2DM的共同靶點出發(fā)，分析其核心靶點及通路。

通過分析交集靶點的PPI網(wǎng)絡，得出AKT1、IL-6、TP53等是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的潛在核心靶點。AKT1是AKT的主要亞型之一，是調節(jié)細胞存活信號通路的中心節(jié)點，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是AKT的上游蛋白，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR是AKT1的下游蛋白，三者組成的PI3K/AKT/mTOR軸是介導腫瘤生長代謝與轉移的經(jīng)典途徑，能促進腫瘤細胞的蛋白質等物質合成，抑制細胞自噬等分解代謝。研究表明，該信號通路能通過增強瓦伯格效應（Warburg effect）維持腫瘤細胞的能量補給，并在上皮間質轉化過程（EMT）中發(fā)揮重要作用，促進CRC細胞的轉移。AKT1是T2DM的重要治療靶點。Yin等通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)，AKT1/AKT2基因變異患者T2DM 的發(fā)病率明顯升高，提示PI3K/AKT/mTOR可能參與了T2DM的發(fā)病過程。研究表明，胰島素是PI3K/AKT 途徑調節(jié)物質代謝的主要配體，PI3K/AKT信號途徑激活能使過量葡萄糖轉移至胞外用于組織吸收，可以減輕肥胖和胰島素抵抗，并且有調節(jié)糖尿病患者腸道菌群的作用。Toda 等發(fā)現(xiàn)，AKT1/AKT2敲除會導致與胰島素受體敲除類似的糖異生基因表達增加和糖耐量受損的現(xiàn)象。本研究KEGG通路富集分析結果顯示，PI3K/AKT/mTOR途徑是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的重要通路。

IL-6可由人體多種細胞產生，在高壓或應激狀態(tài)下主要通過棕色脂肪組織產生并持續(xù)維持在較高水平，能促進肝臟糖原異生，導致機體血糖升高。酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）和信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）是IL-6的下游靶點，IL-6/JAK2/STAT3是致癌信號通路之一，IL-6分泌增多引起STAT3升高，會抑制多種抗腫瘤細胞的成熟活化，誘導腫瘤免疫抑制，并通過影響間充質干細胞增殖促進CRC的轉移。研究表明，靶向IL-6可增強腫瘤特異性Th1反應，靶向IL-6或STAT3聯(lián)合免疫治療可提高抗腫瘤療效。

除上述核心靶點外，其余靶點對葛根芩連湯治療CRC和T2DM也可能發(fā)揮作用。VEGFA能促進CRC微血管生成，是影響CRC轉移的重要因子。雌激素受體1（ESR1）能促進葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）表達，并提高胰島素敏感性，改善血糖穩(wěn)態(tài)。上述研究進一步論證了中藥復方多靶點協(xié)同治療疾病的特色。

分子對接結果顯示，AKT1、IL-6、TP53等核心靶點與槲皮素、芹菜素、葛根素等葛根芩連湯的核心成分結合程度良好。可視化分析顯示核心成分與TP53之間有緊密的化學鍵連接，也進一步證明葛根芩連湯可能通過槲皮素、葛根素等成分作用于TP53、AKT1等核心靶點，進而對CRC和T2DM起到改善作用。

GO功能和KEGG通路富集分析結果顯示，葛根芩連湯治療CRC和T2DM主要涉及調節(jié)細胞因子、影響激素分泌與物質代謝、細胞的分化成熟凋亡等機制，提示葛根芩連湯在調節(jié)炎癥反應方面有一定的作用。此外，葛根芩連湯可能通過調節(jié)轉錄因子的活性，影響蛋白質及酶類的合成代謝，繼而影響癌細胞的生長或轉移，同時影響糖酵解、糖原異生等重要糖代謝途徑，在血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在激素分泌方面，葛根芩連湯可能通過PI3K/AKT信號途徑改善胰島素抵抗進而發(fā)揮降糖作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法對葛根芩連湯“異病同治”CRC與T2DM的作用機制進行蛋白與通路層面的分析，表明葛根芩連湯的成分與CRC和T2DM的共同靶點之間存在良好的化學連接，葛根芩連湯可能通過調節(jié)細胞炎癥因子表達、介導物質代謝、影響細胞存活/凋亡途徑等共同途徑治療CRC與T2DM，且與PI3K/AKT、IL-6/JAK2/STAT3等信號通路密切相關，可為中醫(yī)“異病同治”理論及臨床治療CRC和T2DM提供分子依據(jù)。但本研究僅為生物信息學數(shù)據(jù)分析，仍需后續(xù)研究進一步完善相關機制的論證。