伊立替康活性代謝物SN38對皮膚鱗狀細胞癌細胞壞死性凋亡的調節機制

王佳雯 朱君

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是人類常見的皮膚腫瘤，約占所有非黑素細胞皮膚癌的20%[1]，在老年人中更常見，多發生在頭面部、外陰和外生殖器區域，治療以手術切除、激光、冷凍和放療為主[2]。SN38是伊立替康的活性代謝物，其類似的藥效機制與5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑相似，均可以引起DNA損傷的反應，被認為是決定細胞死亡或存活的結果[3-5]。壞死和凋亡是細胞死亡的兩種主要形式，壞死在傳統意義上通常被認為是一個“非程序性”的細胞死亡過程，但最近研究發現它也可以通過一種稱為壞死或程序性壞死的機制發生[6]。與細胞凋亡不同，壞死不是由胱門蛋白酶介導的，但可以被RIP1的特異性小分子抑制劑Necrostatin-1（NEC-1）抑制，通過作用于蛋白絲氨酸（RIP1）和蘇氨酸激酶（RIP3）的激酶部分，引發RIP1激酶的二聚化，抑制激酶活性，阻斷RIP1和 RIP3的相互磷酸化。壞死可由活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細胞因子、烷基化DNA損傷或照射觸發，并通過獨特的信號通路受體相互作用RIP1/RIP3執行[7-8]，在與腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導配體誘導的壞死中，聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）也可作為RIP1/RIP3的下游效應因子。越來越多的證據表明，壞死調節因子的遺傳或表觀遺傳調控發生在癌癥中，并與患者的臨床結果相關[8]。該研究旨在探討伊立替康活性代謝物SN38對CSCC細胞A431壞死性凋亡的調節機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人CSCC細胞A431購自南京科陌生物科技有限公司，采用RMPI-1640培養液和10% 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美國）在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.2 細胞轉染 將對數期生長的A431細胞使用6孔

板進行細胞鋪板，待細胞融合度達到70%左右時參照Lipofectamine 2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，美國）說明書將shRIP3或shRNA轉染A431細胞（System Biosciences，CA，美國）：（1）將A431細胞用胰酶消化，以1,000 r/min離心5 min，洗滌后采用RMPI-1640培養液重懸，置于24孔板中培養過夜，每孔5×104個；（2）將shRIP3或shRNA轉染A431細胞48 h后收集假病毒顆粒；（3）用聚烯（8μg/mL）存在下的假病毒顆粒感染A431細胞，用嘌呤霉素選擇48 h以穩定shRIP3或shRNA表達。通過RT-PCR法證實了RIP3基因的敲低。用免疫熒光檢測shRIP3轉染效率。

1.3 細胞增殖試驗 采用噻唑藍比色法測定人CSCC細胞增殖能力。將對數期生長細胞使用96 孔板進行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預，隨后連續4 d每天每孔加入16μL MTT（5 mg/mL），在細胞培養箱中孵育4 h棄去上清液，添加150μL二甲亞砜溶解沉淀，常溫搖床放置20 min，最后通過酶標儀測定各孔480 nm波長時的吸光度。

1.4 細胞凋亡試驗 采用流式細胞儀技術檢測細胞凋亡。將對數期生長細胞使用6 孔板進行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預。待干預48 h后，參照 AnnexinV FITC試劑盒（BD，美國）說明書處理各組細胞，隨后采用流式細胞儀技術測定各組細胞凋亡率。

1.5 蛋白質印跡法 將對數期生長細胞使用6孔板進行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預。待干預48 h 后，將收集好的細胞參照RIPA裂解液說明書提取總蛋白，定量、變性，制備凝膠，每孔上樣量40 μg，常規電泳、轉膜、封閉，抗RIP抗體（1∶1,000）（Abcam，美國），抗RIP3抗體（1∶1,000）（Abcam，美國）及抗GAPDH抗體（1∶2,000），4 ℃孵育過夜，第2天使用相應二抗室溫孵育1 h后，ECL發光液處理后暗室內曝光膠片，掃描結果保存。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。所有實驗均獨立重復3次，計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NEC-1對SN38干預A431細胞增殖的影響 SN38組A431細胞增殖率低于正常對照組，而SN38+NEC-1組A431細胞增殖率高于SN38組，但仍較正常對照組低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可以抑制A431細胞增殖，使用RIP1的特異性小分子抑制劑NEC-1干預后可降低A431細胞對SN38的敏感性，從而導致細胞增殖能力增加。見圖1。

圖1 NEC-1對SN38干預A431細胞增殖的影響

2.2 NEC-1對SN38干預A431細胞凋亡水平的影響 正常對照組A431細胞凋亡率為（4.02±0.04）%，SN38組A431細胞的凋亡率為（19.00±2.06）%，而SN38+NEC-1組A431細胞凋亡率為（11.37±1.67）%，組間差異有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可以促進A431細胞凋亡，使用RIP1的特異性小分子抑制劑NEC-1干預后可降低SN38對A431細胞的凋亡水平。見圖2。

圖2 NEC-1對SN38干預A431細胞凋亡水平的影響

2.3 NEC-1對SN38干預A431細胞壞死性凋亡蛋白水平影響 SN38組RIP1/RIP3蛋白表達量較正常對照組明顯增加，SN38+NEC-1組RIP1/RIP3蛋白表達量較SN38組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達水平。見圖3。

圖3 NEC-1對SN38干預A431細胞壞死性凋亡蛋白水平的影響

2.4 NEC-1對SN38干預A431細胞壞死性凋亡下游效應蛋白的影響 SN38組PARP-1蛋白較正常對照組明顯增高，SN38+NEC-1組PARP-1蛋白較SN38組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可影響PARP-1蛋白表達水平。見圖4。

圖4 NEC-1對SN38干預A431細胞壞死性凋亡下游效應因子的影響

2.5 轉染shRNA和shRIP3效率的免疫熒光檢測 空白對照組未見到熒光染色，SN38+shRNA組（空載體組）可以見到細胞內出現免疫熒光，SN38+shRIP3組細胞內也出現免疫熒光。見圖5。

圖5 shRNA和shRIP3轉染效率的免疫熒光（×40）

2.6 shRIP3對SN38干預A431細胞壞死性凋亡蛋白水平的影響 SN38+shRIP3組RIP1/RIP3蛋白表達量較SN38組明顯降低，而SN38+shRNA組與SN38組比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達水平。見圖6。

圖6 shRIP3對SN38干預A431細胞壞死性凋亡蛋白水平的影響

2.7 shRIP3對SN38干預A431細胞凋亡水平的影響 正常對照組的細胞凋亡率為（0.23±0.03）%，SN38組A431細胞的凋亡率為（11.60±2.52）%，而SN38+shRIP3組A431細胞凋亡率為（5.58±0.85）%，組間差異均有統計學意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達水平促進A431細胞凋亡。見圖7。

圖7 shRIP3對SN38干預A431細胞凋亡水平的影響

2.8 shRIP3對SN38干預A431細胞壞死性凋亡下游效應蛋白的影響 SN38組PARP-1蛋白表達量較正常對照組明顯增高，SN38+shRIP3組PARP-1蛋白較SN38組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖8。提示SN38可影響PARP-1蛋白表達水平。

圖8 shRIP3對SN38干預A431細胞壞死性凋亡下游效應蛋白的影響

3 討論

CSCC是一種起源于角質形成細胞的皮膚癌，具有很強的轉移潛能[11]。年齡、種族、暴露于紫外線輻射、陽光敏感的皮膚和免疫抑制是CSCC的典型危險因素[12]。在大多數情況下，非轉移性CSCC可以通過手術切除來治愈。然而，轉移性、復發性、不可切除的CSCC病例仍需要新的治療策略和藥物。

SN38是伊立替康的活性代謝物，是一種廣泛應用的拓撲異構酶I抑制劑，通過促進壞死的進展，抑制細胞增殖，誘導DNA損傷積累，并且這種損傷所導致的TNF/TNFR信號通路介導的細胞毒性使SN38誘導的RIP1激活和壞死對結直腸癌有治療作用[13]。目前，對伊立替康耐藥或敏感性的基礎仍未明確，因此有必要確定識別易感患者和逆轉耐藥的策略[14-16]。最近有研究發現，這種耐藥性可能與代謝改變有關，包括ATP檸檬酸裂解酶的上調、AKT通路的激活[15]、p38MAPK通路的上調[16]和腫瘤缺氧[17]，使用各種信號抑制劑的試驗正在進行中。本研究發現，SN38干預的A431細胞增殖能力下降，凋亡水平增高，可能是與SN38誘導的RIP1/RIP3信號通路激活有關，聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）作為RIP/RIP3的下游效應因子也隨之被激活。

壞死是一種具有壞死形態的程序性細胞死亡，發生在多種生物過程中，包括炎癥、免疫反應、胚胎發育和代謝異常。目前，普遍將壞死定義為由受體相互作用的RIP1/RIP3的信號轉導介導的細胞死亡，大量研究強調了RIP1/RIP3在癌癥中的作用[18]。CHEN等[17]研究發現，壞死是應對嚴重應激和阻斷細胞凋亡的關鍵細胞殺傷機制，并提出它可以作為一種替代的細胞死亡方案來預防癌癥。既往研究表明，RIP3表達的增加與癌癥的發展相關，包括結腸癌、肺癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤[19-20]。本研究發現，應用壞死性凋亡抑制劑或者基因沉默RIP3（shRNA RIP3）可使A431細胞對伊立替康耐藥性增加，說明在一定程度上A431細胞對伊立替康的耐藥性是由于抑制壞死性凋亡實現的，激活壞死性凋亡信號通路可能增加A431細胞對伊立替康化療的敏感性。

綜上所述，伊立替康活性代謝物SN38對可抑制A431細胞增殖，使其凋亡水平增加，可能是由SN38誘導RIP1/RIP3/PARP-1信號通路實現的，而當壞死性凋亡信號通路受到抑制時，A431細胞對SN38的敏感性降低，使其耐藥性增強。因此，激活壞死性凋亡信號通路可能是治療CSCC的潛在靶點，為臨床上CSCC的耐藥提供了新的治療思路。