肝細胞生長因子在治療肌腱損傷中的研究進展

李家輝 姚立煒 毛海蛟

作者單位：315211寧波大學（李家輝）315020寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院（姚立煒 毛海蛟）

肌腱損傷是一種常見的臨床疾病，隨著社會老齡化程度的加重，其發(fā)病率不斷增長。研究顯示，芬蘭50歲以上人群中肩袖損傷的發(fā)病率從30年前的23%升高至現在的65%[1]；韓國跟腱斷裂的發(fā)病率由2009年的0.21‰增加到2017年的0.26‰[2]；高發(fā)病率的肌腱損傷也給社會帶來了巨大的經濟負擔[3]。盡管肌腱損傷的治療水平不斷提升，但肌腱的再生能力弱，其力學性能往往恢復不到正常肌腱的一半[4-5]。因此，如何使肌腱在損傷后獲得更好的修復是目前亟待解決的問題。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）已被證明可以調節(jié)多種細胞生長、運動和分化[6]，有實驗證實局部注射HGF能夠顯著促進肌腱損傷的愈合[7]，其在組織工程領域的應用也有良好前景[8]。HGF在肌腱修復過程中具有多種生物學功能，該文就HGF促進肌腱損傷修復的相關機制進行綜述。

1 HGF的生物學性狀

HGF由巨噬細胞、內皮細胞和星狀細胞等多種細胞合成，經過多種途徑最后以旁分泌或自分泌的形式促進細胞有絲分裂及DNA合成[9]，在體內廣泛分布，肝臟、肺、心臟等均有表達。HGF的表達受多種激素和細胞因子的共同調節(jié)，包括各種炎癥介質和血漿中的細胞因子。在正常人體中，HGF通常以無活性的單鏈蛋白形式流通，并儲存在細胞外基質中，但是當人體受到損害時，HGF則通過誘導尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）激活纖溶反應，從而將原HGF裂解為活性HGF[10]。同時，HGF還有多種生物學作用，比如作為肝再生因子具有促進肝細胞分裂增殖的作用，可以誘導骨髓間充質干細胞分化為成熟的肝細胞以促進肝臟再生。此外，HGF也可作為各種干細胞的有絲分裂原參與各類器官的損傷修復，研究表明在動物實驗中HGF能夠有效促進胃黏膜細胞的增殖分裂來加速胃黏膜損傷的修復，促進腎小管上皮細胞的再生來加速腎功能的恢復，促進子宮內膜上皮細胞的增生來加速受損子宮內膜的修復，刺激支氣管上皮細胞的增殖來加速支氣管黏膜損傷的修復等[11]。此外，HGF還與腫瘤的轉移、生長和發(fā)展密切相關[12]。

2. HGF的促肌腱愈合作用

2.1 HGF通過抗炎作用促進肌腱損傷愈合 HGF于1984年被發(fā)現，最初是從血漿和血小板中純化獲得的一種多功能細胞因子，能刺激多種類型細胞的分化、增殖、再生、遷移及形態(tài)發(fā)生[13]。研究發(fā)現，HGF在多種器官和損傷的修復中起著重要作用，同時HGF在肌腱損傷修復中也起著獨特的作用[14]。已有研究表明，炎癥是肌腱干細胞病理性分化的重要因素之一，而HGF已被證明具有抗炎作用，其可通過抑制由IL-1誘導的COX-1、COX-2和mPGES-1等炎癥基因的表達，從而抑制巨噬細胞等炎癥細胞的聚集，也可通過破壞轉錄因子NF-κB介導的信號通路來減少炎癥反應。YUKSEL等[15]利用小鼠制作跟腱缺損模型，A組用10 ng HGF處理，B組用10 ng HGF+10 ng HGF抗體處理，C組為等劑量0.9%NaCl溶液對照處理，結果顯示10 ng HGF治療組術后1、3、12 d的炎癥因子水平明顯低于其他兩組，蛋白免疫印跡顯示COX-1和COX-2蛋白水平也明顯低于其他兩組，證明HGF可以有效抑制炎癥反應。ZHANG等[16]也利用大鼠跟腱缺損模型，A組用肌腱干細胞+HGF處理，B組單用肌腱干細胞處理，C組用等量0.9%NaCl溶液作為對照，結果在第1周肌腱干細胞+HGF實驗組的大鼠M2巨噬細胞（抗炎）數量明顯高于其他兩組，而M1巨噬細胞（促炎）數量明顯低于其他兩組，體外實驗中IL-6、COX-2、TGF-β1、α-SMA等炎癥基因表達均明顯下調，切片顯示第4周和第8周A組肌腱標本表現出更完整的膠原纖維排列，均提示HGF通過抑制炎癥表達促進了肌腱損傷的愈合。但是，目前抗炎研究多局限于動物實驗，其具體臨床作用尚需進一步探討。

2.2 HGF通過抑制肌腱纖維化促進肌腱損傷愈合 肌腱損傷后愈合形成以Ⅲ型膠原為主要成分的纖維瘢痕組織，成纖維細胞的不定向分化和細胞外基質的過度表達已被證明是肌腱修復中纖維化瘢痕形成的主要因素[17]。HGF可通過抑制TGF-β1 的促纖維化作用而促進組織再生，阻抑TGF-β1誘導的肌腱成纖維細胞增殖和α-SMA 蛋白過度表達，從而抑制α-SMA 蛋白主導的Ⅲ型膠原粘附，最后有效抑制肌腱修復過程中的肌腱粘附及瘢痕增生[18]。YAO 等[18]的實驗在大鼠肌腱粘附模型中局部注射HGF，結果顯示實驗組的Ⅲ型膠原蛋白的產生和α-SMA等纖維化基因的表達顯著低于對照組，體外實驗也發(fā)現HGF顯著抑制了TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖，證明HGF能夠有效抑制肌腱修復過程中的纖維化形成。CHEN 等[19]通過實驗發(fā)現，HGF可抑制NF-κB介導的RelA/p65通路表達，進而抑制纖維化，阻抑p65抑制的成纖維細胞凋亡，從而抑制成纖維細胞增殖。還有研究表明，HGF通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路在腎間質纖維化過程中的高表達，從而抑制腎間質纖維化[20]。CUI等[21]利用大鼠跟腱缺損模型，A組局部注射100 ng HGF處理，B組注射同量0.9%NaCl溶液作對照，結果顯示HGF實驗組的α-SMA 蛋白和Ⅲ型膠原表達明顯低于對照組，組織切片也顯示實驗組較對照組有更規(guī)則緊密的膠原排列，提示HGF可抑制肌腱修復過程中的瘢痕形成，從而抑制肌腱纖維化修復。由此可見，HGF抑制肌腱成纖維細胞增殖的作用已較為明確，但成纖維細胞也是肌腱修復過程中不可或缺的一部分，如何平衡二者的動態(tài)關系還需進一步探討。

2.3 HGF通過調控肌腱干細胞分化增殖促進肌腱損傷愈合 肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）是近年來新發(fā)現的一類肌腱來源的干細胞[22]，對肌腱損傷的修復具有獨特優(yōu)勢，而且制備簡便，易于體外培養(yǎng)及傳代等。同時，無論是自體還是同種異體TDSCs都具有較低的免疫原性，避免了自身機體產生排異及炎性反應，進而避免給機體帶來二次損傷與破壞。實驗也證實，TDSCs能夠在體外特異性表達Ⅰ、Ⅲ型膠原及蛋白多糖，并且具有持續(xù)合成Ⅰ型膠原的能力[23]，是TDSCs修復肌腱的優(yōu)勢所在。另外，TDSCs也具有多向分化的潛能，意味著其不僅可以分化為肌腱細胞，在一定的病理條件下還能分化為骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞和脂肪細胞等非肌腱細胞[24]。因此，HGF調控TDSCs的定向分化作用就顯得尤為關鍵。ZHANG等[8]利用加入了HGF的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)TDSCs，培養(yǎng)24 h后檢測肌腱細胞標志物Fmod、COLⅠ、COLⅢ和主要的肌腱基因Eyal、Egrl、Scx，結果發(fā)現HGF組的肌腱標志物表達顯著高于對照組，表明TDSCs在HGF的誘導下向肌腱細胞分化的能力明顯增強。HAN等[25]分別使用濃度為0、10、20、40、80 ng/mL的 HGF與TDSCs共同培養(yǎng)，結果發(fā)現0 ng/mL濃度組的Runχ2和Alp成骨基因表達較高，表明該組成骨樣分化；但隨著濃度的升高COLⅠ、COLⅢ、TEN-C和 SCx的表達上調，顯示TDSCs成腱樣分化，表明HGF的促分化作用與作用時間及濃度相關。當HGF受到抑制時，肌腱纖維排列松散不規(guī)則，纖維間隙明顯增大，COLⅢ、α-SMA 和TGF-β1等纖維化成分生成均顯著增加；當HGF表達增加時，肌腱纖維排列規(guī)則、緊密[16]。上述實驗結果均可表明，HGF可調控TDSCs向肌腱細胞定向分化，但具體調控機制尚需進一步研究。

2.4 HGF通過參與構建組織工程材料修復肌腱損傷 近年來，組織工程技術的迅猛發(fā)展給肌腱損傷的修復帶來新的希望。利用組織工程三要素“種子細胞、生物因子、工程支架”，將種子細胞種植于生物相容性好的人工材料支架中，利用生物因子將其向肌腱組織定向分化[26]，培養(yǎng)成成熟人工肌腱之后植入患處，從而達到再生修復肌腱損傷的目的。近年來，陸續(xù)有實驗證明HGF與其他生物工程材料聯合應用可以取得更好的治療效果。ZHANG等[27]通過構建兔前交叉韌帶重建模型，將明膠海綿和骨髓間充質干細胞作為人工肌腱支架，同時用HGF浸泡處理，實驗證明用HGF處理的實驗組表現出更好的力學性能和組織學評分，在肌腱-骨連接處表現出更完整的軟骨形成和膠原排列。隨后HEXTER等[28]也利用羊制作前交叉韌帶重建模型，A組使用2 mL纖維蛋白（fibrin Sealant，FS）單獨注入指狀肌腱移植物，B組使用HGF+2 mL FS注入指狀肌腱移植物，C組為對照組做單純指狀肌腱移植物置入，結果顯示術后12周HGF+FS處理組的肌腱生物力學明顯優(yōu)于其他兩組，影像學評分也顯示該組肌腱成熟度明顯高于其他兩組，也證明聯合應用HGF與組織工程材料可以更好地促進肌腱損傷后的愈合。由于目前研究多為局限于動物實驗，也缺少多種組織材料聯合作用的比較研究，其作用機制尚需進一步研究。

3 HGF作用于肌腱損傷信號傳導通路的可能機制

作為生長因子的一種，HGF有眾多的信號通路，c-Met作為其特異性受體在肌腱修復中發(fā)揮著重要作用，HGF/c-Met信號通路由HGF和其受體c-Met構成，兩者結合后c-Met自身上的兩個酪氨酸殘基磷酸化，繼續(xù)激活受體上的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK），激活的PTK進一步激活后續(xù)細胞內不同的信號通路，比如RAS /RAF/MEK/ EKR信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB和STAT3通路等，引起細胞增殖、分化等一系列生物學效應[29]。HAN等[25]實驗證實，HGF可激活HGF/c-Met進而介導其下游AKT和ERK1/2磷酸化，促進TDSCs的增殖和遷移能力。HGF還可通過激活肌成纖維細胞中的單磷酸腺苷激酶（AMPK）通路和粘著斑激酶（FAK）通路抑制TGF-β1的成纖維作用[30-31]。除此之外，HGF還可通過抑制NF-κB介導的非特異性炎癥反應促進肌腱修復[32]。不過，以上通路均缺少在肌腱修復中的臨床實驗證據，HGF在肌腱修復中的具體作用機制有待進一步研究。

4 小結與展望

肌腱損傷作為運動醫(yī)學的臨床難點之一，逐漸引起社會的重視，但目前臨床上尚無十分有效的標準治療方法。肌腱損傷的修復及調控機制是一個復雜的過程，不僅是細胞的增殖分化，還包括炎癥反應的調控和纖維粘連的調節(jié)。眾多研究表明，HGF是治療肌腱損傷的有效工具，可在抗炎、抗纖維化、調控細胞分化等各方面促進肌腱損傷的修復，但因肌腱修復的機制過程十分復雜，眾多影響因素交互作用，因此HGF的作用機制還需進一步探索，為其臨床應用尋求合適的方案。同時，人工肌腱的構建已成為治療肌腱損傷的研究熱點，HGF作為生物因子在未來人工肌腱的構建中必將占有一席之地，相信未來臨床對肌腱損傷的修復將會有更行之有效的方法。