基于16S rRNA測序技術(shù)分析HLAP患者腸道微生態(tài)變化及與IL-1、TNF-α的關(guān)聯(lián)性

黃奕森，曾以琳，張長青，陳雅妮，王育斌

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院消化內(nèi)科，泉州 362000）

高脂血癥性急性胰腺炎(Hyperlipidemic Acute Pancreatitis，HLAP)是由高三酰甘油血癥而誘發(fā)的急性胰腺炎，患者臨床上可出現(xiàn)胰腺局部炎性反應(yīng)，更嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征及器官功能衰竭。伴隨著我國生活方式以及飲食習(xí)慣的變化，高三酰甘油血癥已經(jīng)成為了急性胰腺炎的主要發(fā)病因素，同時其發(fā)病率也正逐年升高，但目前對于其發(fā)病機制并不清楚，且主要治療手段也不理想[2]。有文獻(xiàn)記載，當(dāng)腸道出現(xiàn)細(xì)菌易位，脂多糖等一系列毒素入侵體內(nèi)時，免疫細(xì)胞識別后會分泌大量的炎性因子，促進(jìn)機體進(jìn)入低炎性狀態(tài)，所以對于患者機體炎性反映的檢測也是較為重要的[3]。腸道菌群變化是腸道微環(huán)境以及腸道結(jié)構(gòu)功能的重要影響成分，有研究發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎患者需要較長時間的禁食，這會導(dǎo)致腸道菌群失衡以及腸道屏障功能受到破壞[4]。但目前對于腸道微生態(tài)變化是否促進(jìn)HLAP的發(fā)生與發(fā)展還有待考究[5]。因此本研究選取我院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康體檢者臨床資料進(jìn)行分析，研究基于16S rRNA測序技術(shù)分析HLAP患者腸道微生態(tài)變化及與IL-1、TNF-α的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2020年12月泉州市第一醫(yī)院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康體檢者作為研究對象，將其中高脂血癥性急性胰腺炎列入HLAP組（n=33），非高脂血癥性急性胰腺炎列入非HLAP組（n=27），健康體檢者作為對照組（n=61）。HALP組33例，男性16例，女性17例，年齡38~61歲，平均年齡（53.23±5.98）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.41±1.01）kg/m2；非HALP組患者27例，男性14例，女性13例，年齡37~61歲，平均年齡（53.08±5.46）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.31±1.12）kg/m2，對照組61例，男性31例，女性30例，年齡37~61歲，平均年齡（53.11±5.61）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.24±1.07）kg/m2，兩組患者一般資料差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（P＞0.05）（見表1）。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合《急性胰腺炎的診斷和治療》[6]中急性胰腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；HALP組患者伴有靜脈乳糜血且TG 5.65～11.3 mmol/L或血清三酰甘油 （TG）>11.3 mmol/L；患者未合并其他系統(tǒng)性疾病，如高血壓、糖尿病、心臟病、腎病、肝病等；患者精神意志正常可配合治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并惡性腫瘤、白血病等重大疾病；患者半年內(nèi)曾使用免疫抑制劑；患者胃腸功能障礙，入院2天內(nèi)腸功能未恢復(fù)者；入選者資料不完整；懷孕和哺乳期女性。

1.2方法 腸道檢查微生態(tài)檢查方法:病例組患者均在入院第一時間提取糞便并進(jìn)行檢測，對照組時間一致。收集糞便2 g，將其分裝于無菌干燥小瓶內(nèi)，同時標(biāo)記后放于-80℃冰箱內(nèi)保存。采用16S rRNA測序技術(shù)分析HLAP患者腸道菌群，將標(biāo)本給予深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和對比。糞便內(nèi)DNA提取以及16S rDNA擴增方法：糞便細(xì)菌的總DNA嚴(yán)格按照購自翌圣生物上海科技有限公司的MolPureStool DNA Kit糞便DNA提取試劑盒進(jìn)行檢測；樣本使用前以及高通量測序方法：將擴增子片段回收，同時采用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶以T4多核苷酸激酶把黏性末端恢復(fù)為平末端，隨后將堿基A加于3端，促進(jìn)DNA片段與3端具有T堿基的特殊接頭相連，設(shè)計合成具有測序接頭的雙探針融合引物，將基因組DNA設(shè)置為模板，隨后開始融合引物PCR，運用磁珠篩選目的擴增子片段，隨后采用合適的文庫開始制備簇以及測序。16S rDNA V4可變區(qū)引物序列：正向引物為5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3',反向引物3'-GGACTACHV GGGTWTCT-AAT-5'。在98℃下反應(yīng)2 min，在95℃下反應(yīng)20 s，在50℃下反應(yīng)30 s，在72℃下反應(yīng)30 s，以此順序反復(fù)進(jìn)行30次，再次在72℃下反應(yīng)30 s，使用Ampure XP beads排除掉非目產(chǎn)物。平均分子長度以上海安捷倫科技有限公司的2100生物分析工具進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)分析：采取條碼序列以內(nèi)部所制作的程序?qū)悠凡鸱帧l碼序列和測序的比對不允許有錯誤配對。在Hiseq2500，測序長度為P250，模式為PE250+8+8+250的平臺開始雙末端測序，下機數(shù)據(jù)將低質(zhì)量序列去除，剩下的高質(zhì)量數(shù)據(jù)運用在后期的分析中；將序列間相重疊的序列拼接為標(biāo)簽；在所獲得相似度下將標(biāo)簽換做為運算分類單位，隨后采用運算分類單位和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對運算分類單位進(jìn)行物種注釋；在運算分類單位的基礎(chǔ)上與物種注釋結(jié)構(gòu)進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度的對比分析以及組間物種差異分析。樣本組間差異分析：采用統(tǒng)計學(xué)方法對兩組樣本間的微生物豐度差異性進(jìn)行測量，同時使用錯誤發(fā)現(xiàn)率對差異性顯著性進(jìn)行評估。在門綱目科屬種之間差異性進(jìn)行評價。采用Metastats軟件對組間差異性進(jìn)行分析。

血清學(xué)檢測方法：血清學(xué)抽取時間與糞便樣品收集時間一致。抽取患者空腹靜脈血5 mL，并取2 mL放置于未加入抗凝劑的試管內(nèi)，在常溫下靜置1 h，隨后以轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/min，持續(xù)離心5 min，分離血清并冷藏于-80℃的冰箱內(nèi)，送至檢驗科。IL-1選取上海雙贏生物科技有限公司的IL-1 ELISA定量檢測試劑盒并采用酶聯(lián)免疫吸附定量檢測法進(jìn)行檢測；TNF-α選取上海康朗生物技術(shù)有限公司的TNF-α檢測試劑盒并采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測。

1.3觀察指標(biāo) 對比三組入選者腸道微生態(tài)以及血清IL-1、TNF-α水平；對比HALP組和非HLAP組患者腸道微生態(tài)。患者微生態(tài)以chao指數(shù)和shannon指數(shù)進(jìn)行表達(dá)，chao指數(shù)：樣本內(nèi)群落的豐度，也就是樣本中物種的數(shù)量，但并不指群落內(nèi)每個物種豐度。shannon指數(shù)：指的是群落內(nèi)多樣性，群落內(nèi)物種的豐富度和均勻度能夠?qū)ζ湓斐捎绊憽?/p>

1.4方法 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。年齡計量資料以(±s)的形式表示，組間采用獨立樣本t檢驗、組內(nèi)均采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，記P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組入選者糞便微生態(tài)對比 與對照組相比，HLAP組和非HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低；與非HLAP組相比，HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2三組入選者IL-1和TNF-α水平對比 與對照組相比，HLAP組和非HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高；與非HLAP組相比，HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 三組入選者糞便微生態(tài)對比(±s)

表1 三組入選者糞便微生態(tài)對比(±s)

注：與對照組相比a P＜0.05；與非HLAP組相比b P＜0.05。

組別 運算分類單位 chao指數(shù) shannon指數(shù)HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）對照組（n=61）2.51±0.18ab 2.78±0.26a 3.19±0.22 90.58＜0.001 FP 182.23±5.65ab 210.19±5.45a 224.23±5.89 575.29＜0.001 187.53±5.11ab 201.23±5.31a 218.77±5.12 409.01＜0.001

表2 三組入選者IL-1和TNF-α水平對比(±s)

表2 三組入選者IL-1和TNF-α水平對比(±s)

注：與對照組相比a P＜0.05；與非HLAP組相比b P＜0.05。

組別 IL-1（pg/L） TNF-α（pg/L）HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）對照組（n=61）108.21±10.08ab 64.52±10.31a 15.09±10.49 895.80＜0.001 FP 69.43±3.65ab 60.23±3.42a 40.51±3.39 823.98＜0.001

2.3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比 相比于非HLAP組患者，HLAP組患者厚壁菌門、擬桿菌門顯著更低，變形菌門、梭桿菌門以及放線菌門顯著更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比 相比于非HLAP組患者，HLAP組患者雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、薩特菌屬和艾克曼菌屬顯著更高，擬桿菌屬、瘤胃球菌、梭菌屬、戴阿利斯特菌屬以及巨球菌屬顯著更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比(±s)

表3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比(±s)

組別 厚壁菌門 變形菌門 擬桿菌門 梭桿菌門 放線菌門HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 41.56±5.43 48.08±3.42 5.417＜0.001 19.52±3.28 10.23±3.41 7.724＜0.001 21.56±3.51 40.12±3.38 20.717＜0.001 2.89±0.57 0.57±0.49 16.691＜0.001 3.56±0.43 1.23±0.59 17.675＜0.001

3 討論

隨著我國生活水平的提升以及不良飲食習(xí)慣的變法，我國高三酰甘油血癥的發(fā)病率日益增加[7]。HALP又被稱為高三酰甘油血癥性胰腺炎，高三酰甘油血癥是急性胰腺炎的常見致病因素[8-9]。有研究統(tǒng)計，HALP占到急性胰腺炎的40%左右，且發(fā)病率有升高的趨勢[10]。腸道微生態(tài)是人類微生態(tài)中最大的組成部分，研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)在急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-12]。但目前對于HALP患者腸道微生態(tài)學(xué)研究較少，因此本次研究對其展開研究并檢測患者血清炎性指標(biāo)進(jìn)行分析，為臨床的診治提供參考。

16S rRNA（16S核糖體RNA）測序技術(shù)是細(xì)菌編碼rRNA所對應(yīng)的DNA序列，在所有的細(xì)菌基因組內(nèi)均存在，具有準(zhǔn)確、快速和靈敏的特點，可全方位表達(dá)腸道菌群的種類、分布以及豐度[13]。本次研究則采用分析HLAP患者和同期健康體檢者患者腸道菌群顯示，與對照組相比，HLAP組和非HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低；與非HLAP組相比，HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低。這說明，HLAP在患者發(fā)病中存在較為明顯的腸道微生態(tài)異常。研究過程中發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎發(fā)生時機體受刺激而釋放出多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，而IL-1作為一種細(xì)胞因子，是活化單核巨噬細(xì)胞所生成，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞抗體的大量生成，具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的作用，在HLAP的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[14]。而TNF-α在HLAP的發(fā)生過程中具有始動作用，其作為一種促炎性細(xì)胞因子，是炎性反應(yīng)的敏感指標(biāo)，誘導(dǎo)IL-1等基因表達(dá),導(dǎo)致炎癥介質(zhì)失控性釋放,并促進(jìn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎癥介質(zhì)分泌，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[15]。在脂肪酶的促進(jìn)下，三酰甘油會被分解為游離脂肪酸，而游離脂肪酸對于胰腺腺泡細(xì)胞以及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成影響[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HLAP組和非HLAP組IL-1和TNFα水平顯著更高；與非HLAP組相比，HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高。筆者推測由于IL-1和TNF-α的生物膜細(xì)胞毒作用可對生物膜直接造成損傷，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞和細(xì)胞器的腫脹異變，通透性也會隨之升高，且其作為能夠介導(dǎo)機體感染、創(chuàng)傷和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，參與了機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程，因此其水平越高表明患者病情越嚴(yán)重[18-19]。厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門以及放線菌門都是消化道內(nèi)較為多見的細(xì)菌。本次研究發(fā)現(xiàn)，相比于非HLAP組患者，HLAP組患者厚壁菌門、擬桿菌門顯著更低，變形菌門、梭桿菌門以及放線菌門顯著更高。這表明，HLAP組患者比非HLAP組急性胰腺炎患者腸道失衡更為明顯。在菌屬中，擬桿菌變化并不大，而其他菌屬均出現(xiàn)明顯的變化。其中對人體有害的擬桿菌屬、瘤胃球菌、梭菌屬、戴阿利斯特菌屬以及巨球菌屬出現(xiàn)明顯的降低，而雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、薩特菌屬和艾克曼菌屬明顯增加，這可能是因為機體對于菌群失衡以及腸道菌群移位的阻止形式[20-21]。本次研究通過對比性研究發(fā)現(xiàn)，HLAP患者腸道微生態(tài)以及炎性反應(yīng)均出現(xiàn)明顯的失衡，存在相關(guān)性。但本次研究可能因為病例收集的因素，導(dǎo)致實驗存在一定偏差，以后因彌補此不足。

綜上所述，腸道微生態(tài)的失衡與HLAP患者存在明顯的相關(guān)性，在其發(fā)展過程中扮演著重要的角色，同時患者伴隨著炎性因子的升高。日后，我們需加強對高三酰甘油患者的管理，以預(yù)防和減少急性胰腺炎尤其是重癥急性胰腺炎的發(fā)生。

表4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

表4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

組別 擬桿菌屬 雙歧桿菌屬 瘤胃球菌屬 梭菌屬 鏈球菌屬HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 19.43±5.08 22.14±5.12 2.041 0.045 2.45±0.51 0.43±0.28 21.945＜0.001 2.53±0.42 3.61±0.38 10.338＜0.001 5.41±1.42 11.87±1.54 16.877＜0.001 5.65±0.42 0.32±0.24 58.530＜0.001

續(xù)表4 HLAP組和非HLAP組治療后糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

續(xù)表4 HLAP組和非HLAP組治療后糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

組別 薩特菌屬 艾克曼菌屬 戴阿利斯特菌屬 巨單胞菌屬 巨球菌屬HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 3.89±0.43 1.24±0.46 23.015＜0.001 3.75±0.48 1.15±0.42 22.064＜0.001 0.88±0.43 2.78±0.31 19.221＜0.001 3.65±1.54 8.79±1.68 12.344＜0.001 0.54±0.28 3.89±0.41 37.484＜0.001