Lnc RNA TUC338 影響人類宮頸癌細胞的蛋白組學分析

蔣漪樺，朱 宇，杜洪靈，秦錦龍，劉 曄，宋君雅，蔡驍垚，金 姝1，，4

（1.南華大學衡陽醫學院，湖南 衡陽 421001；2.上海市普陀區人民醫院婦產科，上海 200060；3.上海市普陀區人民醫院檢驗科，上海 200060；4.上海市普陀區人民醫院中心實驗室，上海 200060）

長鏈非編碼RNA（Lnc RNA）是一類讀碼框之外的RNA，近年來Lnc RNA 被發現存在多種生物功能，在癌癥、免疫、神經、心血管等多種系統中存在重要作用，尤其在癌癥領域的研究成為熱點。在腫瘤的診斷、藥物治療的靶點、判斷腫瘤預后等方面均取得進展。Lnc RNA TUC 338 長度為590 bp，位于人類第12 對染色體長臂上。對于Lnc RNA TUC 338 的研究較少，已發現在肺癌[1]、膀胱癌[2]和食管癌[3]中，Lnc RNA TUC338 均通過不同機制促進癌癥發展，提示其為一種癌基因。而宮頸癌作為女性生殖系統的三大腫瘤之一，嚴重影響女性的生理、心理健康[4]，一定程度上也影響了兩性關系的和諧[5]。Lnc RNA TUC 338 在人類宮頸癌中的相關研究較少，本研究探索了Lnc RNA TUC 338 在宮頸癌的發展中的作用及其影響宮頸癌細胞的發展的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人類宮頸癌細胞Hela 細胞購于中國科學院細胞庫。胎牛血清DMEM 培養基、0.25%胰酶購于賽默飛世爾生物化學制品有限公司（北京）；磷酸鹽緩沖液（PBS），購于索萊寶科技有限公司（北京）；DNA 分子量標準Ladder H1（100-1000 bp），購于生工生物工程股份有限公司（上海）；RNAfast 200 總RNA 提取試劑盒，購于飛捷生物技術有限公司（上海）；FastKing RT Kit 試劑盒、FastFire qPCR PreMix試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京）；引物合成：生工生物工程股份有限公司（上海）；病毒包裝：維諾賽生物技術有限公司（武漢）。

1.2 儀器 離心機：Eppendorf 離心機Centrifuge 5418；顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；熒光顯微鏡：Nikon ECLIPSE Ti 熒光顯微鏡；PCR 儀：BIORAD My Cycler；酶標儀：BioTek Synergy H1 全功能酶標儀；電泳儀：Tanon EPS 300 電泳儀；電泳設：Bio-Rad SDS-PAGE 電泳設備；凝膠成像分析系統：Tanon 1600。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染 將HELA 細胞以每孔1×106個置于6 孔板中，每孔加入濃度10%FBS 的DMEM 2 ml，5%CO2、37 ℃培養箱中培養，取對數生長期的細胞，每48 h 進行細胞傳代，待細胞融合度達60%～70%時，按慢病毒使用說明書以脂質體法分別轉染慢病毒，將HELA 細胞分為兩組：轉染rLVhTUC338-ZsGreen-Puro 慢病毒（實驗組，以下簡稱TUC338 組）、轉染rLV-ZsGreen-Puro 對照組病毒（對照組，以下簡稱rLV 組），轉染48 h 后以2 μg/ml的比例加入嘌呤霉素殺滅未轉染細胞，48 h 后再殺滅1 次，培養至細胞融合度達80%后進行以下各種實驗。

1.3.2 RT-PCR 實驗驗證Lnc RNA TUC338 擴增 待細胞基本鋪滿板底時按照RNAfast 200 總RNA 提取試劑盒的說明書提取細胞RNA，按照天根FastKing RT Kit（with gDNase）說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，按照天根FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒說明書，將cDNA 目的基因進行擴增，條件為：94 ℃3 min，94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃30 s循環39 次，72 ℃10 min 退火。TUC338 引物：Forward：TCAACTTAATCCCACACTGACC，Reverse：GAGCCTTGGAGACTGAACATC。以β-actin 為內參照，β -actin 引 物：Forward：CTCGCCTTTGCCGATCC，Reverse：TCTCCATGTCGTCCCAGTTG。將擴增的目的基因分別進行蛋白電泳，以1000 bpMarker為參照。

1.3.3 細胞送樣及蛋白測序 將每組細胞樣本分為3 個組別，送至北京諾禾致源技術公司，通過非標記定量方法（Label-free）對蛋白質酶解肽段進行質譜分析。

1.3.4 蛋白質譜分析 通過非標記定量方法（Labelfree）對2 組細胞的蛋白質酶解肽段進行定量、差異和富集分析。

1.3.5 TUC338 對蛋白基因本體功能（GO）的影響分析 分析基因本體功能（GeneOntology，GO）（www.geneontology.org），包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）、生物過程（BP）。

1.3.6 KEGG 分析 通過Pathway 的主要公共數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）分析出已確定蛋白質參與的重要信號轉導途徑和生化代謝途徑。

1.3.7 蛋白結構域分析 利用Interproscan 軟件對蛋白質結構域分析，數據庫包括Pfam、ProDom、SMART 等。

1.3.8 亞細胞定位分析 采用Cell-mPLOC 2.0 網站對測出的蛋白進行亞細胞的定位，亞細胞包括細胞核、線粒體、內質網、高爾基體、細胞膜和胞漿等。

1.3.9 蛋白互作分析 對鑒定到的蛋白進行蛋白互作分析，應用數據庫http://string-db.org/（StringDB 蛋白互作數據庫）。

1.4 統計學分析 使用SPSS 22.0 軟件對所得到的實驗結果進行統計學分析，采用t檢驗比較組間差異，P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達TUC338 穩定細胞系和總蛋白鑒定 已篩選穩定的細胞系：熒光顯微鏡下見兩組細胞熒光顯色均為100%，慢病毒感染成功，見圖1A；Lnc RNA TUC338 在實驗組中的表達：經RT-PCR 實驗，可見相較于對照組，實驗組中的Lnc RNA TUC338 基因顯著過表達，見圖1B；總蛋白鑒定：對提取到的蛋白進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并進行考馬斯亮藍染色，兩組均顯示較多的蛋白條帶，見圖1C，提取蛋白成功。

圖1 過表達TUC338 穩定細胞系和總蛋白鑒定

2.2 蛋白質譜分析

2.2.1 差異蛋白分析 蛋白定量分析共檢測到4323個蛋白。蛋白差異分析顯示：與rLV 組比較，在TUC338 組中下調的蛋白有194 個，上調的蛋白有225 個。以火山圖（圖2A）和熱圖（圖2B）表示。其中，重要的下調蛋白有：LAMB1、HNRNPH3、COX2、FADS2、GPATCH4、CAV1、AHNAK、PFKM、MAVS、ANP32E 等。重要的上調蛋白有：EPPK1、ITPR1、AKR1C2、MFF、PTGS2、PNPLA6、AKR1B1、ITGA1、PTGFRN、TGM2 等。

圖2 TUC338 影響宮頸癌細胞中蛋白差異表達的分析

2.2.2 TUC338 對蛋白基因本體功能的影響 GO 富集注釋結果柱狀圖顯示，BP 前3 位為：膀胱介導轉運（vesicle-mediated transport）29 個蛋白，轉運（transport）45 個蛋白、細胞內蛋白轉運（intracellular protein transport）45 個蛋白；MF 前3 位為：鈣離子結合（calcium ion binding）79 個蛋白、蛋白激酶活性（protein kinase activity）85 個蛋白；CC 前3 位為：細胞外區域組分（extracellular region）15 個蛋白、內質網組分（endoplasmic reticulum）17 個蛋白，見圖3A；與rLV 組比較，rLV-TUC338 組中顯著下調BP，包括：真空轉運、細胞組分組裝、自噬體組裝等6 組（P＜0.05）。MF 包括：磷酸轉移酶活性，醇基作為受體、細胞色素-c 氧化酶活性、激酶活性等7 組。無顯著的下調CC 蛋白見圖3B。與rLV 組比較，rLVTUC338 組中顯著的上調BP 包括：細胞鐵離子穩態、脂代謝過程、磷脂分解代謝過程等9 組。MF 包括：三價鐵結合、內肽酶抑制劑活性、蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶活性等9 組。CC 包括：細胞外區域部分、細胞外空間、細胞骨架等5 組，見圖3C。

圖3 基因本體功能分析

圖3 基因本體功能分析（續）

2.2.3 KEGG 分析 KEGG 富集注釋結果柱狀圖顯示，共注釋到了包括：細胞過程，轉運和代謝（Transport and catabolism）313 個蛋白、真核生物（Cellular community-eukaryotes）162 個蛋白、細胞運動（Cell motility）75 個蛋白等，共44 個KEGG 途徑。其中，注釋到最多蛋白的途徑為代謝總譜（541 個蛋白）見圖4A。顯著下調KEGG 通路有半乳糖代謝（Galactose metabolism）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）等共6 個（P＜0.05），見圖4B、表1。顯著的上調KEGG 通路有肌動蛋白細胞骨架調節（Regulation of actin cytoskeleton）等共20 個，見圖4 C，表2。

表1 KEGG 分析中重要的下調蛋白

表2 KEGG 分析中重要的上調蛋白

圖4 KEGG 分析

圖4 KEGG 分析（續）

2.2.4 蛋白結構域分析 結構域注釋結果柱狀圖顯示共檢測到含WD40 repeat 結構域（WD40 repeat）等20 個蛋白結構域，見圖5A。rLV 組和rLV-TUC338組中有顯著差異的結構域包括血紅蛋白過氧化酶結構域，動物（Haem peroxidase，animal）等，見圖5B。

圖5 蛋白結構域分析

2.2.5 亞細胞定位分析 蛋白亞細胞定位占比統計分析顯示，主要亞細胞成分為：核蛋白（nucleus protein）占34.23%、細胞質蛋白（cytoplasm protein）占16.16%、線粒體蛋白（mitochondrion protein）占14.22%、內質網蛋白占8.44%；剩余由細胞膜蛋白、細胞外蛋白、高爾基體蛋白、細胞骨架蛋白、溶酶體蛋白等構成，見圖6A。差異蛋白亞細胞定位占比統計分析顯示，主要差異亞細胞成分為：核蛋白（nucleus protein）31 個，占24.22%、細胞質蛋白（cytoplasm protein）23 個，占17.97%、細胞外蛋白（extracell protein）20 個，占15.62%，見圖6B。

圖6 亞細胞定位分析

2.2.6 蛋白互作分析 在rLV 組和rLV-TUC338 組中，下調的互作網主要包括：prot1（P37268）-prot2（O95864）、prot1（Q6FGH9）-prot2（Q13363）等。上調的互作網主要包括：prot1 （P60520）-prot2（A0A024RBQ5）、prot1（P60520）-prot2（Q06330）等，見圖7。

圖7 蛋白互作網絡圖

3 討論

差異蛋白分析發現Lnc RNA TUC338 下調了Hela 細胞的一些蛋白，從多種途徑抑制腫瘤發展。其中PFKM 是糖酵解重要調節酶之一，負責催化6-磷酸果糖磷酸化為1，6-二磷酸果糖。糖代謝是支持腫瘤發展的重要代謝途徑，PFKM 在多種腫瘤中呈高表達狀態，比如在頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）中被確定為靶基因[6]。PFKM 對糖酵解的代謝重編也使乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力提高[7]。在宮頸癌中，PFKM 也存在異常高表達[8]。另一下調蛋白ANP32E即酸性核磷蛋白32 家族成員E，是一種組蛋白伴侶，負責調節各種基因的表達。已有研究證實其與乳腺癌的發生相關[9]；在甲狀腺癌的研究中，ANP32E 上調激活AKT-mTOR-HK2 信號通路，增強糖酵解，促進甲狀腺癌細胞增殖和遷移[10]。這些與PFKM 協同，均提示Lnc RNA TUC338 可降低糖代謝，從而抑制宮頸癌細胞的增殖。Lnc RNA TUC338 上調了一些蛋白，其中透明相關formin 1（DIAPH1）是一種激動蛋白成核酶，參與細胞骨架的調節，可與紡錘體-微管（MT）高親和力結合，起到穩定染色體的作用[11]。這種作用機制與紫杉醇相同，且DIAPH1 可協同紫杉醇穩定微管，增加卵巢癌對紫杉醇的藥物敏感性[12]。DIAPH1 的上調提示Lnc RNA TUC338 通過改變細胞骨架通路，穩定細胞狀態，抑制腫瘤進展。

GO 分析發現，Lnc RNA TUC338 下調了一些GO，其中重要的下調BP 為磷酸化。磷酸化途徑中的膜相關酪氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（PKMYT1）為膜相關激酶，是WEE 家族的一員，特異性磷酸化絡氨酸（Tyr）15 和Thr14[13]，絡氨酸的磷酸化影響代謝酶活性，使腫瘤發展[14]。另外，PKMYT1 可通過磷酸化并滅活細胞周期蛋白依賴性激酶1，調控G2/M 期之間的轉換，并對DNA 進行損傷修復，導致細胞周期失控，在多種癌癥中均高表達[15]。rLV-TUC338 組中重要的下調MF 為磷酸轉移酶活性；其中，絲裂原活化蛋白激酶激酶2（MAP2K2）磷酸化并激活MAPK1/ERK2和MAPK2/ERK3，在MAPK 信號轉導中起到關鍵作用，促進有絲分裂。通過抑制MAP2K1 及MAP2K2可阻斷該信號轉導，從而抑制細胞增殖[16]。磷酸化及磷酸轉移酶活性途徑的下調，提示Lnc RNA TUC338抑制腫瘤增殖的機制，可能與抑制磷酸化過程有關。

KEGG 分析發現，Lnc RNA TUC338 下調了一些KEGG 通路。KEGG 中最顯著的下調信號通路為半乳糖代謝。半乳糖是細胞代謝中必不可少的單糖，參與多種生物學功能。目前研究發現越來越多的疾病涉及半乳糖代謝[17]。半乳糖糖代謝在腫瘤發展過程中亦起到重要作用。其中磷酸葡萄糖變位酶1（PGM1），具有催化葡萄糖1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖6-磷酸（G-6-P）之間互相轉化的作用，參與糖原分解及合成，被認為是一種癌基因。在肺癌中，葡萄糖剝奪狀態時，AMP 活化蛋白激酶（AMPK）作為PGM1 的上游調控因子，使PGM1 表達增強，促進糖酵解，強化腫瘤代謝，促進癌細胞進展[18]。敲低PGM1可顯著降低糖酵解，抑制腫瘤細胞增殖[19]。KEGG 中最顯著的上調信號通路為肌動蛋白細胞骨架調節。肌動蛋白細胞骨架有多種生物學功能，包括維持細胞內鈣離子穩態[20]、通過氧化還原作用調節血管細胞的遷移、增殖以及收縮[21]等。肌動蛋白細胞骨架在腫瘤細胞中對細胞遷移能力有很大影響[22]。其中磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶2 型α（PIP4K2A），涉及磷酸化及細胞骨架2 個途徑。在磷酸化途徑中，可磷酸化5-磷酸磷脂酰肌醇，參與調節多種重要的細胞功能，包括增殖、遷移、免疫、物質運輸及葡萄糖攝取等[23，24]。在細胞骨架途徑中，可以維持線粒體的結構及功能穩態[25]。有研究顯示[26]，PIP4K2A 為抑癌基因，其在腦膠質母細胞瘤中負向調節磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信號傳導，降解P85，從而抑制腫瘤生長。上述結果提示Lnc RNA TUC338 抑制腫瘤增殖，其機制可能與抑制半乳糖代謝及活化細胞骨架通路有關。

綜上所述，Lnc RNA TUC338 改變了人類宮頸癌細胞的蛋白組學，是宮頸癌的抑癌基因。主要通過糖代謝、磷酸化、細胞骨架途徑實現其抑癌作用。

致謝：感謝上海同濟大學生命科學院博導、教授陸東東對本次研究的技術指導與論文撰寫指導。