強化阿托伐他汀治療對PCI患者EMPs、Th17/Treg水平及Notch1信號通路的影響

陳園月,陸永光,陳麗媛，黃軍章，陳 林，仇昌智 (欽州市第二人民醫院心內科，廣西 欽州 535099)

越來越多的研究表明急性冠狀動脈綜合征(ACS)的進展過程中存在急慢性炎性反應及病理性免疫反應[1]，炎性及免疫細胞的過度激活與血管內不穩定性斑塊密切相關[2-3]。經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是治療ACS的有效方法，手術后存在的心肌損害仍是棘手問題。EMPs的功能與內皮細胞有關，它可以通過作為細胞介質和黏附分子的載體來轉導細胞信號[4]。有研究表明，ACS患者EMPs表達增多[5]。 哺乳動物的Notch信號通路由4種Notch受體(Notch1～4)和5種配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)組成，當配體與受體胞外區結合后，發生酶切，然后經Y-分泌酶二次酶切，激活相關基因的表達。研究發現Notch信號通路可加重內皮細胞衰老及炎性反應[6]。于是提出Notch信號與動脈粥樣硬化有關。巨噬細胞在動脈硬化進展中扮演著中心角色。研究表明，激活的巨噬細胞通過介導 Notch1 及其下游目標基因和炎性效應因子而參與促炎反應，從而具有促進ACS發生的作用[7]。但目前還沒有Notch信號通路與EMPs關系的相關具體研究。本研究旨在探討兩者之間關系。

阿托伐他汀是冠心病的主要治療藥物，效果顯著，但其對Th17/Treg及Notch1信號通路的影響研究較少。本研究觀察了ACS患者外周血Th17、Treg變化及Notch1受體變化，探討阿托伐他汀治療對Th17、Treg的作用及EMPs誘導CD4+T淋巴細胞亞群分化和效應分子的表達機制和EMPs與Notch1信號轉導通路的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2017年2月～2018年1月本院收治的ACS患者112例為研究對象。納入標準：包括不穩定性心絞痛及急性心肌梗死并擇期行PCI術的患者。排除標準：既往有腦卒中、近1個月內使用非甾體抗炎藥、激素、免疫抑制劑或他汀類藥物；合并肝腎功能障礙、免疫及風濕性疾病或腫瘤；合并感染性疾病或發熱；妊娠及哺乳期婦女。將患者隨機分為阿托伐他汀強化治療組(強化組)和阿托伐他汀常規治療組(常規組)各56例。本研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2治療方法：強化組和常規組均積極控制基礎疾病，給予冠心病二級預防常規治療等。在此基礎上強化組口服阿托伐他汀鈣片術前服用 80 mg/d，術后服用40 mg/d，而常規組術前、術后服用20 mg/d。

1.3血清Treg、Th17檢測：強化組及常規組分別于術前、術后1周抽取靜脈血，制備單淋巴細胞懸液，采用流式細胞儀(美國BD 公司)檢測 Th17、Treg，計算 Treg/Th17。

1.3.1單淋巴細胞懸液制備：將標本加入分離液中，離心0.5 h，使用PBS洗滌細胞，然后液氮保存。

1.3.2Th17檢測：解凍淋巴細胞，經培養及加入抗體孵育后，采用流式細胞儀檢測Th17，計算比例。

1.3.3Treg檢測：于單細胞懸液加入抗體，經破膜及孵育后，采用流式細胞儀檢測Treg。

1.4ROR-yt mRNA、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA水平表達檢測：采用逆轉錄PCR法。取各組樣本，采用TRIzol法提取總RNA；合成第一鏈cDNA；構建熒光定量PCR 反應體系。反應條件為95℃2 min、95℃ 20 s、60℃ 30 s、68 ℃ 55 s(40個循環)。以 GAPDH 為 內參，計算ROR-yt、Foxp3 mRNA Notch1 mRNA相對表達量。ROR-yt 上游引物：CCTGGGCTCCTCGCCT-GACC，下游引物：TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC。Foxp3上游引物：CTGGCAAATGGTGTCTGCAAGT，下游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA。Notch1基因引物序列上游引物ACAGCCTCAACGGGTACAAG，下游引物GGCAGACACAGGAGAAGCTC。

1.5IL-17檢測：取1.4標本離心后取血清，按試劑說明書，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-17。

1.6EMPs檢測：在患者入院后次日清晨空腹及術后1周時采取患者外周靜脈血抽取患者3 ml，離心后獲取含血小板的血漿。取50 μl血小板血漿加入特異性標記抗體0.5 μg或等量的同型對照抗體(鼠IgG1/PE，鼠IgG1/FITC，美國BD公司生產)。在室溫下孵育20 min后加用PBS后，用流式細胞儀檢測。檢測過程在血樣收集后4 h內完成。EMPs定義為直徑<1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒。

1.7統計學方法:采用SPSS17.0統計學軟件進行t檢驗與χ2檢驗；兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1兩組Th17、Treg表達的比較：與術前比較，術后Th17下降，差異有統計學意義(均P<0.01)。與常規組比較，強化組Th17降低，差異有統計學意義(均P<0.01)。與術前比較，術后Treg及Treg/Th17表達量升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。與常規組比較，強化組Treg及Treg/Th17表達量升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。見表1。

表1 兩組Th17、Treg及Treg/Th17水平比較

2.2兩組ROR-yt、Foxp3和Notch1 mRNA表達比較：與術前比較，術后ROR-yt、Notch1 mRNA下降；與常規組比較，強化組ROR-yt、Notch1 mRNA下降，差異均有統計學意義(均P<0.01)。與術前比較，術后(Foxp3) mRNA升高；與常規組比較，強化組(Foxp3) mRNA升高，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 兩組血漿ROR-yt、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA表達水平比較

2.3兩組EMPs、IL-17水平比較：與術前比較，術后EMPs、IL-17下降；與常規組比較，強化組EMPs、IL-17下降，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表3。

2.4相關性分析：結果顯示EMPs與 Foxp3 mRNA水平均呈負相關，EMPs與Notch1 mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17水平均呈正相關。

表3 兩組EMPs、IL-17水平比較

3 討論

Th17和Treg是來源相同，分化卻不同的一組免疫炎性反應調控T細胞亞群，它們互相調節及抑制。Th17可分泌IL-17等多種細胞因子，激活病理免疫反應。有研究證實，Th17/Treg失衡在系統性紅斑狼瘡等免疫系統疾病發生、發展演變過程發揮重要作用[8-9]，本課題也充分體現了Th17/Treg失衡在ACS中發揮的重要地位。研究顯示，動脈硬化模型小鼠的Th17及轉錄因子ROR-yt升高，說明Th17升高加速了動脈硬化進展[10]。既往試驗表明ACS患者Th17及IL-17明顯升高，說明Th17升高加劇了冠脈斑塊的不穩定性[11]。而本次試驗結論也符合該論點。Treg具有抑制免疫及抑制炎性反應的特性。Treg可分泌TGF-β和IL-10及抑制和下調炎性反應因子及單核細胞趨化因子表達，減少泡沫細胞形成及炎性細胞積聚，減輕動脈粥樣硬化。Treg還可加快血脂分解，尤其低蛋白脂蛋白，下調血脂水平，抑制斑塊內泡沫細胞增殖及血管內皮細胞活化[12]。

ROR-yt是Th17細胞的轉錄因子，誘導Th17細胞的分化和IL-17基因的轉錄。ROR-yt參與Th17介導的炎性反應免疫系統疾病的發生、發展，主要通過誘導Th17細分泌IL-17等細胞因子。Foxp3是Treg細胞的轉錄因子，Foxp3通過介導Treg分化、發育、表達而發揮重要免疫抑制作用。

不僅ROR-yt、Foxp3 會誘導Th17細胞及Treg細胞分化及相關細胞因子的轉錄。已有研究表明CD4+T細胞表達的Notch1細胞因子，也能夠調控Thl7、Treg分化和免疫功能。本研究表明，上述CD4+T關鍵轉錄因子Notch1及其mRNA表達水平在ACS患者中均有改變，表明其不同程度參與了冠狀動脈粥樣硬化和粥樣斑塊不穩定的免疫調控。

在淋巴細胞發育原始階段，Notch1受體可決定其向T、B細胞分化的命運[13]，Notch1在淋巴細胞的發育初期階段有促進淋巴樣前體細胞向T細胞分化，抑制其向B細胞分化的作用，而缺乏Notch1信號激活誘導的淋巴樣前體細胞則會發育為B細胞。所以說Notch1在T細胞分化、發育過程中發揮重要作用，而且是Notch其他家屬成員無法替代的。Zheng[14]研究發現，腎移植術后不同恢復程度的患者Th17細胞水平表達量明顯不同，與Notch的表達量成正相關，提示在腎移植急性排斥反應中Th17細胞的增殖和分化與Notchl密切相關。而本試驗ACS患者ROR-yt mRNA和IL-17也呈正相關。

有試驗應用Notchl siRNA阻滯劑阻斷Notch1信號通路，不但可以降低轉錄因子RORYt mRNA的表達，還能顯著降低人類Th17細胞分泌的IL-17A、IL-17F 等細胞因子[15]，提示Notchl至少可通過轉錄因子ROR-yt 和IL-17基因啟動子2個位點調控Th17細胞分化和功能。

本研究EMPs 與Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相關，因此，本研究推測EMPs誘導CD4+T淋巴細胞亞群分化和效應分子的表達可能通過對相應關鍵轉錄因子FOXP3和ROR-yt及Notch1信號通路的調控實現。CD4+T淋巴細胞亞群的效應分子還可反作用于CD4+T淋巴細胞，影響其分化和功能的發揮，它們之間存在著復雜的相互作用和調控網絡。

本研究112例ACS患者，與治療前比較，治療后強化組Th17、IL-17水平、ROR-yt mRNA及Notch1-mRNA表達量均較治療前及常規組治療后降低，Treg及Treg/Th17、Foxp3 mRNA表達量較治療前及常規組治療后升高，EMPs 水平低于術前且強化組較常規組變化更明顯，EMPs與Treg、Foxp3 mRNA水平均呈負相關。EMPs 與Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相關，提示急性冠脈綜合征患者體內存在Th17、Treg失衡，強化阿托伐他汀通過下調Th17細胞IL-17及抑制Notch1表達糾正Th17/Treg失衡，而減輕ACS術后心肌炎性反應。

綜上所述，阿托伐他汀通過下調EMPs水平有助于糾正Th17/Treg失衡，從而減輕炎性反應。同時Notch1信號通路由于對T細胞分化及發育中發揮重要生物學作用，其在動脈硬化形成發展階段有重要影響，激活及加劇粥樣斑塊的炎性反應和斑塊的不穩定性。使其成為新的藥物作用靶。隨著研究的深入，進一步闡明Notch1信號通路在疾病發生、發展中的分子機制，Notch1有望作為新的藥物治療靶點。