木犀草素促進鼻咽癌細胞凋亡和自噬的機制

王海茹，曹 卉，譚湘敏，龍 綺 (.海口市人民醫院 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 海口 57008；.海口市人民醫院 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院中心實驗室，海南 海口 57008)

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤[1]，常見于東南亞國家，在我國通常集中發生在南方，尤其是廣東、廣西等地。由于鼻咽癌放化療不良反應大、生物治療費用昂貴，因此對鼻咽癌發病的分子機制進行研究，尋找療效好且不良反應小的抗鼻咽癌藥物是臨床上亟待解決的問題。自噬，又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是細胞內降解細胞器的唯一途徑，與腫瘤發生、發展，腫瘤的轉移和能量代謝等過程有關[2]。研究鼻咽癌細胞凋亡、自噬及其信號通路有助于深入了解鼻咽癌的分子機制，為鼻咽癌治療提供新方法。

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于多種藥用植物中，如錦葵科、菊科、唇形科、馬鞭草科、傘形科等。木犀草素可在多靶點、多途徑、多環節產生抗腫瘤作用[3-4]。研究表明，木犀草素可以誘導自噬、抑制腫瘤細胞增殖[3-4]，但木犀草素是否對鼻咽癌細胞自噬有影響未知。因此本研究用木犀草素處理鼻咽癌細胞，觀察其對細胞增殖凋亡的影響以及能否引起自噬，從而探討木犀草素對鼻咽癌的作用機制。

1 資料與方法

1.1材料來源：本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。人鼻咽癌CNE-1細胞(來自廣州塞庫生物技術有限公司)在RPMI-1640培養基中培養(含10%胎牛血清)，并置于37℃和5%二氧化碳的恒溫細胞培養箱中。木犀草素(貨號: 491-70-3) 購自德思特生物技術有限公司，胎牛血清、RPMI-1640培養基、青鏈霉素購自美國Hyclone公司，四氮唑藍鹽化合物(MTS)、缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒購自美國Promega公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自keygen公司，凋亡抑制蛋白(Bcl-2)、微管相關蛋白輕鏈3蛋白(LC3B)、泛素結合蛋白(p62)、自噬效應蛋白(Beclin-1)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶(AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTS法檢測細胞增殖:將對數生長期的人鼻咽癌CNE-1細胞按 1×104個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的木犀草素(0、20、40、60、80、100 μmol/L)，其中0 μmol/L組[未加木犀草素，只加等體積的二甲基亞砜(DMSO)稀釋液]作為對照組，每個組設 3個復孔，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。收集培養后各個時間點的細胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入1/10檢測試劑(即100 μl培養液加入10 μl檢測液)孵育4 h后，再用酶標儀檢測儀讀取OD490數值。實驗重復3次，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(其他時間點OD值均值÷0 h OD值均值-1)×100%。

1.2.2流式細胞檢測細胞凋亡：CNE-1細胞接種于6孔板，細胞密度為1.5×104/well，接種后繼續培養于37℃、5% CO2的培養箱中24 h，待細胞貼壁后，按照加入的木犀草素濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)分為五組，對照組為加入等量培養基的細胞，各組都設3個復孔。培養48 h后棄去原培養基，0.25%胰蛋白酶消化后將細胞重懸于培養基中(密度約1×106細胞/ml)，轉移含5×105個細胞的細胞懸液于離心管中，加入1.25 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液雙染，用流式細胞儀檢測CEN-1細胞凋亡率。

1.2.3透射電鏡觀察細胞內自噬體:將1×106個CNE-1細胞接種到10 cm平皿中培養，培養24 h后加入藥物，加入藥物48 h后，細胞培養24 h，加入不同濃度木犀草素(20、40、60、80、100 μmol/L)48 h，同時設立對照組，胰酶消化細胞，離心，重復離心兩次后棄上清。2.5%戊二醛固定4℃2 h以上，1%鋨酸固定2 h，依次加入梯度乙醇脫水，丙酮固定，包埋固化和切片后，枸櫞酸鉛染色，用透射電鏡觀察后拍照。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達水平:將CNE-1細胞按1×106個細胞接種至培養瓶中，放入培養箱中培養24 h，開始加入藥物，CNE-1細胞經不同濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素處理24 h后胰酶消化細胞，離心5 min后棄上清， 用PBS重懸細胞，繼續離心2次后棄上清，加入提取緩沖液后4℃輕搖15 min。收集裂解液到EP管中，14 000 r/min離心15 min。取上清到新的EP管中。二奎啉甲酸(BCA)法測量蛋白濃度，電轉移后轉膜，脫脂奶粉封閉后分別加入一抗和二抗，增強化學發光法(ECL)顯影。采用圖像處理軟件(Image J)檢測膜上的蛋白表達條帶，采用Prism 6.0用于統計各蛋白條帶的OD值。檢測指標有Beclin-1、LC3、PI3K、p-AKT和p-mTOR。

2 結果

2.1木犀草素抑制鼻咽癌細胞CNE-1增殖:利用不同濃度的木犀草素分別處理 CNE-1 細胞24 h、48 h、72 h 后，MTS結果顯示，與對照組(0 μmol/L組)相比，木犀草素能夠抑制CNE-1細胞的增殖，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨著濃度和時間的增加，抑制增殖的作用增強。見圖1。

圖1 木犀草素抑制 CNE-1細胞增殖的作用

2.2木犀草素促進CNE-1細胞凋亡:流式細胞儀結果顯示，與對照組相比，不同濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素處理的CNE-1細胞凋亡率顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01)。見圖2。

注：與0 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01圖2 木犀草素對CNE-1細胞凋亡的影響

2.3透射電鏡觀察自噬體情況:不同濃度的木犀草素處理組細胞內均出現自噬體，隨著藥物濃度的增加，細胞自噬小體顯著增多。見圖3。

圖3 木犀草素誘導CNE-1細胞形成自噬體(×5 000)

2.4Western印跡檢測蛋白質表達：Western印跡分析結果顯示，不同濃度的木犀草素隨著濃度增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下降(P<0.05)，自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，p62蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。木犀草素組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達比對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 木犀草素對凋亡及自噬相關蛋白的影響

圖5 木犀草素對P13K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達的影響

3 討論

鼻咽癌是我國耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種和病死因素[5]。放化療是目前主要的治療方法，但晚期低分化鼻咽癌患者對放療的敏感性較低，容易出現復發和轉移[6]。因此發現更加有效的藥物輔助鼻咽癌的治療是亟待解決的問題。木犀草素是由木犀草中分離出而得名，化學名為3，4，5，7-四羥基黃酮。目前對于木犀草素的研究主要集中在抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成方面[7-11]。為了探索木犀草素在治療鼻咽癌中的作用，本研究選擇人鼻咽癌CNE-1細胞作為研究對象，采用MTS法檢測木犀草素對CNE-1細胞增殖的影響，隨著木犀草素濃度的增加，CNE-1細胞的增殖能力顯著降低，提示木犀草素對細胞的增殖具有抑制作用。細胞凋亡和自噬是程序性細胞死亡的兩種死亡方式，可以共同作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞死亡。

自噬，也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，廣泛存在于真核細胞中。 自噬通過將細胞質蛋白或細胞器包裹在單層或雙層中形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體。 最后，封裝的內容物被降解，實現自我消化和細胞器更新[12]。自噬在介導腫瘤發展中起雙刃作用，一方面誘導細胞自噬死亡，抑制腫瘤的發生，另一方面可能對腫瘤細胞的增殖有保護促進作用，自噬對腫瘤的作用與各種細胞類型和特定的腫瘤發展階段有關。目前對自噬的研究中，Beclin1、LC3、和p62是比較公認的自噬標記蛋白。Beclin1是自噬的啟動基因，它有增強自噬的作用[20]。LC3在形成自噬小體過程中起到錨定作用，指導溶酶體包裹，是評價自噬發生水平的重要指標，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ是LC3的非活化形式。當自噬被激活時，LC3-I會將一個小肽水解成 LC3-II 并聚集在自噬體膜上[13]。因此，LC3-Ⅱ水平某種程度上反映了自噬的程度，是細胞內自噬的特異性蛋白標志[14]。p62是自噬吞噬過程中的轉運蛋白，與LC3結合，運輸被溶酶體包裏的細胞器，p62的表達水平和自噬呈負相關。本研究用流式細胞檢測木犀草素處理前后的鼻咽癌細胞凋亡率，發現木犀草素可誘導CNE-1細胞凋亡,并且凋亡率和木犀草濃度的增加相關。Western印跡結果顯示，Bcl-2蛋白表達下降，提示誘導細胞凋亡是木犀草素抑制鼻咽癌生長的重要機制之一。用不同濃度的木犀草素處理鼻咽癌細胞后，發現隨著藥物濃度的升高，被處理細胞自噬小體增加，同時蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，Beclin-1升高，p62下降，這表明木犀草素除了除了明顯抑制CNE-1細胞的活力外，還可促進LC3的表型轉變，提示木犀草素可誘導CNE-1細胞發生自噬。細胞凋亡與自噬之間的關系是復雜的，其互補作用最為普遍且被廣泛認可。在腫瘤細胞中，自噬受多種信號通路的調控[15]，其中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路是最經典的一條。PI3K/Akt/mTOR信號通路由 PI3K、Akt 和mTOR三種蛋白酶構成，PI3K/Akt/mTOR信號通路軸通過促進細胞增殖和阻礙凋亡在NPC的進展中發揮重要作用[16]。此前有報道稱它與細胞功能如增殖、遷移和轉移有關。此外，越來越多的證據表明Akt/ mTOR級聯控制自噬，自噬可以定義呼叫的存活和壞死，并在腫瘤發生中發揮關鍵作用，激活Akt可通過調節mTOR信號通路阻礙自噬。本研究結果表明，木犀草素明顯阻斷了CNE-1細胞中的 PI3K/Akt/mTOR 信號轉導通路，通過刺激CNE-1細胞中的凋亡和(或)自噬抑制腫瘤細胞生長。