miR-143對妊娠期糖尿病胎盤葡萄糖代謝和線粒體功能的作用

麥彩園 (廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

妊娠期糖尿病(GDM)為育齡期的女性孕前有可能潛在的糖耐量異常，或糖代謝正常，到妊娠時才出現的以血糖升高為主要表現的代謝性疾病，是妊娠期常見的并發癥[1]。據統計，全球約15.8%的妊娠婦女存在GDM[2]。GDM會影響母親和后代。母體血糖升高會引起胎兒血糖升高，從而導致胎兒胰島素分泌增加。 胰島素是胎兒生長因子，可導致巨大胎兒，并增加剖宮產和胎兒出生創傷的風險，包括陰道撕裂、難產、窒息等[3]。胎盤本身的代謝對于全面了解胎盤如何調節營養物質的傳遞，能量平衡，胎兒的生長以及胎兒的程序發育至關重要。MicroRNA (miRNA)是一種非編碼RNA，已經在調節細胞增殖、凋亡、代謝等多個領域被廣泛研究[4]，主要通過與靶基因的3' 端非編碼區的結合，對靶因子產生調控作用，從而影響細胞的增殖、凋亡[5]。miR-143位于染色體5號位上，參與脂肪形成，在幾種癌癥中存在下調，可以抑制己糖激酶2(HK-2)并上調有氧糖酵解[6]。miR-143通過抑制Ⅰ型葡萄糖轉運蛋白(GLUT1)，抑制T細胞葡萄糖攝取和糖酵解，調控T細胞分化[7]。Hastie等研究表明，妊娠前肥胖或妊娠前糖尿病婦女的胎盤降低了線粒體呼吸鏈酶的表達，這可能對胎盤功能產生不利影響[8]。腫瘤細胞有氧環境下能夠攝取葡萄糖，生成的丙酮酸不經過氧化磷酸化，而在胞質中酵解形成乳酸，為瓦氏效應(Warburg effect)或有氧糖酵解[9]。已有研究顯示，胎盤滋養細胞具有相同的特性，依賴于有氧糖酵解供能[10]。本文研究GDM患者胎盤中miR-143的表達情況，檢測滋養細胞有氧糖酵解代謝、線粒體功能有關指標水平，分析miR-143對GDM患者胎盤線粒體功能及葡萄糖代謝的影響。

1 資料與方法

1.1儀器及試劑

1.1.1儀器：實時PCR檢測系統：Bio-Rad公司，美國。熒光素酶報告檢測系統：Progmega公司，美國。

1.1.2試劑：酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、引物：Bio-Rad公司，美國。培養基、載體、胎牛血清、脂質體Lipofectamine 2000、pMiR report質粒：Invitrogen公司，美國。質粒抽提試劑盒：Takara公司，中國。miR-143模擬物(miR-143 mimics)和對照物(miR-143 NC)、RNAiMAX：Qiagen公司，德國。Trizol試劑：Takara公司，中國。

1.2收集胎盤組織：本方案按照赫爾辛斯基宣言有關規定，經由本院醫學倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意。選擇2019年8月～2021年7月在本院行剖宮產的GDM患者30例，收集胎盤的原發性絨毛滋養細胞，分為兩組：Diet組為單純飲食組，Drug組為胰島素治療，每組15例。另外對照組15例為無妊娠并發癥的孕婦，收集順產后胎盤組織。三組均為單胎妊娠。胎盤娩出后，清理胎盤表面，自母體面-胎兒面獲取1 cm×1 cm大小的全層胎盤組織，去除羊膜，隨機取3個部位，冷凍并儲存在-80℃冰箱。

1.3胎盤勻漿組織ELISA測定：使用夾心ELISA在胎盤勻漿中測量人胎盤催乳素(hPL)，在涂有與辣根過氧化酶結合的抗hPL抗體包被的孔中將等份的胎盤勻漿孵育。結合的過氧化物酶量和勻漿中hPL的濃度成正比。

1.4實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)：將樣品移到1 ml RNAiso Plus液的EP管，混和均勻，加入氯仿0.2 ml，混和均勻，離心。上層水相移至離心管，加入異丙醇，離心。移去上清液，然后加入乙醇。混和均勻，離心棄去上清液，再加無RNA酶水40 μl，讀取OD值。反轉錄將RNA合成cDNA。用Primer Premier5.0軟件設計、Takara公司合成的引物，引物序列：miR-143上游引物5'-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3'，下游引物5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3'；上游引物5'-GLUT1 CACATGCCTTCTTTGCCAAG-3'，下游引物5'-TCTATACACAGCAGGGCAGGA-3'；HK-2上游引物5'-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3'，下游引物5'-GTACTCCCCTCGTTTGTGCAG-3'；磷酸果糖激酶(PFK)上游引物5'-GTACGAATTCTTGGCCTGACCTGAAT-3'，下游引物5'-GCGCCCCGGGCCGACTCTTATGTTGTGT-3'；乳酸脫氫酶(LDH)上游引物5'-TATCGAGAATCTGATCGCAGAAGAC-3'，下游引物5'-GGGCAACAAGTTCATCAGCCAAATCC-3'；過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)上游引物5'-GACCACAAACGATGACCCTC-3'，下游引物5'-ATGTTGCGACTGCGGTTG；-3'過氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)上游引物5'-GCAGTGGGGATGTCTCATAATGC-3'，下游引物5'-CAGGGGGGTGATGTGTTTTGAAC-3'；U6上游引物5'-GGTGGTGGAGAACTCTTCA-3'，下游引物5'-GAGCAGCGTCTTCAGGAGCA-3'。反應體系: TaqMan?Fast Advanced Master Mix(2×)10 μl， TaqMan?Advanced miRNA Assay(20×)1 μl， cDNA反應液(1∶10 稀釋)5 μl，無核酸酶水4 μl。按以下條件擴增：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40個循環。miR-143選擇U6做內參，其他因子選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。檢測三組miR-143的表達；三組GLUT1、HK-2、PFK、LDH的水平；三組PGC-1α、PPARγ的水平。使用Rotor-Gene Q Software計算Ct值，用2-ΔΔCT表示相對表達量。所有樣本重復3遍。

1.5細胞分離與培養：用酶消化和percoll梯度純化法從胎盤中分離出絨毛滋養細胞。將細胞接種在Seahorse XF24板，置于37 ℃、5%CO2孵箱，在濃度17 mmoL/L的葡萄糖DMEM培養基中培養。

1.6雙重熒光素酶報告基因檢測、miR-143 mimics進行轉染：在基因網站http://www.targetscan.org/vert_70/上尋找miR-143靶向作用的基因GLUT1(SLC2A1即GLUT1)。將指數生長的滋養細胞以2×105/cm2的密度接種至12孔板，細胞融合達80%，將miR-143 mimics及miR-143 NC進行轉染(按Lipofeetamine 2000轉染試劑盒說明書的方法)，設只加Lipofectamine 2000的對照組。從Drug組胎盤分離的滋養細胞，用1 nmoL/L miR-143 mimics或陰性對照miRNA轉染，再于24 h后，細胞被洗凈并轉染，野生型3’UTR GLUT1和突變型3’UTR GLUT1的pGL3-，熒光素酶報告實驗測量細胞的熒光強度。以miR-143 mimics轉染Drug組滋養細胞，RT-qPCR檢測GLUT1、HK-2、PFK、LDH的水平以及PGC-1α、PPARγ的水平。

2 結果

2.1三組臨床資料比較：三組患者年齡、體重指數(BMI)、孕周、胎兒重量、口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)0 h血糖(OGTT 0 h PG)、OGTT 2 hPG比較，差異無統計學意義(P>0.05)；Diet組較對照組、Drug組胎盤重量增加，胎兒/胎盤重量減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組臨床資料比較

2.2ELISA法檢測三組hPL：Diet組hPL含量明顯高于對照組，Drug組hPL含量明顯高于Diet組和對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 三組入選者胎盤hPL相對表達量比較

圖2 miR-143在三組滋養細胞表達量比較

2.3RT-qPCR檢測三組miR-143水平：miR-143在Drug組滋養細胞中相對表達量均明顯低于對照組和Diet組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4RT-qPCR檢測三組糖代謝指標和線粒體功能：與對照組和Diet組比較，Drug組胎盤中糖代謝相關指標GLUT1、HK-2、PFK和LDH顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，Diet組、Drug組中線粒體呼吸功能相關指標PGC-1α、PPARγ顯著下調，且Drug組PGC-1α、PPARγ顯著低于Diet組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：*P<0.05圖3 三組GLUT1、HK2、PFK和LDH的水平

注：*P<0.05圖4 三組PGC-1α、PPARγ的水平

2.5miR-143可靶向調控GLUT1表達：使用數據庫http://www.targetscan.org/vert_70/驗證miR-143與GLUT1的潛在結合靶點，其結合位點見圖5。而熒光素酶報告基因結果顯示miR-143可顯著抑制野生型pMIR-GLUT1-WT的熒光素酶活性，而不影響突變型pMIR-GLUT1-MT熒光素酶活性。見圖6。

圖5 數據庫預測miR-143和GLUT1結合(SLC2A1即是GLUT1)

注：*P<0.05圖6 熒光素酶報告基因結果

2.6miR-143 mimics轉染對葡萄糖代謝、線粒體功能的影響：以miR-143 mimics轉染Drug組滋養細胞后，GLUT1、HK2、PFK和LDH表達明顯降低，而PGC-1α、PPARγ的表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7、圖8。

注：*P<0.05圖7 miR-143對滋養細胞糖代謝指標的影響

注：*P<0.05圖8 miR-143對滋養細胞線粒體功能的影響

3 討論

胎盤在母體和胎兒同種異體移植物之間提供免疫界面，在母體和胎兒之間運輸營養物質和廢物，并且是影響胎兒、胎盤和母體新陳代謝和發育的肽和類固醇激素的來源。胎盤被認為在GDM的發病機制中起著至關重要的作用，具有物質交換、防御、合成及免疫功能，因為與GDM相關的并發癥會在胎盤分娩后消失[11]。本研究結果說明GDM的胎盤肥大，可以在其呼吸減少時維持胎兒的質量。

hPL對胎兒的生長、胎盤的功能均有影響，它是在孕期適應母體內分泌胰腺的主要刺激因素，增加了β細胞的大量胰島素生成，從而幫助母體在妊娠期間彌補高血糖。在整個妊娠過程中，hPL的濃度逐漸增加，并直接分泌到胎兒和母體循環中，臨床上測定hPL mRNA反映胎盤功能狀態及胎兒宮內發育情況，胎盤變大與母體血液中的hPL水平升高有關[12]。本研究結果符合胎盤組織的hPL水平在GDM患者中明顯增加的表現,也符合胎盤變大與母體hPL水平升高有關的理論。

在健康的人類和大鼠中，進入胎盤的葡萄糖中至少有33%是通過線粒體的氧化磷酸化來實現代謝，可以滿足高代謝率的滋養細胞[13]。PPARγ是一類轉錄因子，通過促進能量沉積或能量耗散來調節能量平衡，PGC-1α是PPARγ的共激活因子，可誘導促進線粒體的生物發生與脂肪酸氧化，PGC-1α和PPARγ的下調都有助于降低Drug組胎盤中的線粒體功能[14-15]。沉默信息調節蛋白(SIRT1)過表達可能通過介導PPARy通路對肥胖大鼠肝臟的脂肪沉積、變性及氧化應激起到了調節作用[16]。妊娠前肥胖或妊娠前糖尿病婦女的胎盤降低了線粒體呼吸鏈酶的表達，這可能對胎盤功能產生不利影響[8]。本研究說明GDM患者的胎盤線粒體功能受損，可能是胎盤代償肥大的原因。這與之前研究的妊娠并發先兆子癇和母體肥胖的孕婦胎盤中線粒體呼吸復合物的表達和活性降低，肥胖母親胎盤分離的滋養層細胞中的呼吸減少一致[17]；也與高脂飲食大鼠中的研究[14]一致。

GLUT1是葡萄糖進入細胞的唯一載體，HK-2是糖酵解途徑的第一個酶，PFK-1是糖酵解的限速酶，是反映最主要的調控位點，LDH在糖代謝中起著重要作用。它們的表達水平對GDM的嚴重程度和預后有診斷和預測價值[18]。GLUT1與糖代謝緊密相關，參與孕婦與胎兒的葡萄糖轉運，是胰島素轉導途徑的最終一步，其在胎盤組織中含量的高低對GDM有重要意義[18]。研究顯示經野生型p53誘導的磷酸酶1(Wip1)特異性抑制劑(GSK2830371)治療，PFK、HK-2和LDH的活性以及肝臟乳酸量均增高，可以進一步促進肝再生并提高肝細胞的有氧糖酵解水平[19]。達英-35聯合二甲雙胍治療大鼠，在卵巢水平上改善其內分泌功能，促進卵泡顆粒細胞增殖，其機制是通過提高糖酵解相關限速酶(GLUT1、HK-2、PFK和LDH)的表達，維持卵泡發育所需要的能量[20]。本研究與糖尿病妊娠中基底膜GLUT1轉運蛋白表達增加的報道一致[21]。GDM胎盤中葡萄糖的可用性和消耗量的增加可能反映在糖酵解途徑中限速酶的表達或活性增加。

Muralimanoharan研究發現來自受藥物控制的GDM胎盤組織中的miR-143明顯降低了50%，miR-143的過表達減少了糖酵解；發現受藥物控制的GDM胎盤中hPL顯著升高，線粒體功能降低，糖酵解增加，miR-143和自噬相關蛋白(mTOR)活化降低，miR-143過表達能夠部分拯救線粒體功能并減少受藥物控制的GDM胎盤滋養層細胞中的糖酵解酶[22]。本研究再次證實了以上結論。

本研究中熒光素酶報告基因法檢測miR-143可靶向調控GLUT1表達。以miR-143 mimics轉染Drug組絨毛滋養細胞后，其結果提示miR-143過表達可導致糖酵解減少，線粒體功能升高。

綜上所述，GDM患者hPL明顯升高，miR-143表達降低，糖酵解增加，線粒體功能降低。miR-143可靶向調控GLUT1，miR-143過表達能夠部分挽救線粒體功能并減少GDM胎盤滋養細胞中的有氧糖酵解。本文樣本量較小，對于miR-143的表達與患者臨床資料的相關性還存在不足，而miR-143對線粒體的調控機制可待進一步研究。